Zweidimensionale nukleare Magnetresonanzspektroskopie

Zweidimensionale nukleare Magnetresonanzspektroskopie (2d nmr) ist ein Satz von Kernresonanzspektroskopie (NMR) Methoden, die Daten ergeben, die in einem Raum aufgetragen werden, der nicht durch zwei Frequenzachsen und nicht von einer definiert ist. Arten von 2D -NMR umfassen Korrelationsspektroskopie (GEMÜTLICH), J-Spektroskopie, Austauschspektroskopie (Exsistent) und Nuklearübersicht Effekt Spektroskopie (Noesy). Zweidimensionaler NMR Spektren Geben Sie mehr Informationen über ein Molekül als eindimensionale NMR-Spektren an und sind besonders nützlich bei der Bestimmung der Struktur von a Molekülinsbesondere für Moleküle, die zu kompliziert sind, um mit eindimensionaler NMR zu arbeiten.

Das erste zweidimensionale Experiment, gemütlich, wurde von vorgeschlagen Jean Jeener, Professor an der Université Libre de Bruxellen, 1971. Dieses Experiment wurde später von Walter P. Auue, Enrico Bartholdi und durchgeführt Richard R. Ernst, der ihre Arbeit 1976 veröffentlichte.[1][2][3]

Grundsätzliche Konzepte

Jedes Experiment besteht aus einer Sequenz von Radiofrequenz (RF) Impulse mit Verzögerungszeiten dazwischen. Das Timing, die Frequenzen und Intensitäten dieser Impulse unterscheiden verschiedene NMR -Experimente voneinander.[4] Fast alle zweidimensionalen Experimente haben vier Stufen: die Vorbereitungszeit, in der eine Magnetisierungskohärenz durch eine Reihe von HF-Impulsen erzeugt wird; Die Evolutionsperiode, eine entschlossene Zeitdauer, in der keine Impulse geliefert werden und die Kernspins frei vorfahren (drehen); die Mischzeit, in der die Kohärenz durch eine andere Reihe von Impulsen in einen Zustand manipuliert wird, der ein beobachtbares Signal ergibt; und die Erkennungszeit, in der die Freier Einführungsverfall Das Signal aus der Probe wird als Funktion der Zeit in einer Weise beobachtet, die mit eindimensionaler FT-NMR identisch ist.[5]

Die beiden Abmessungen eines zweidimensionalen NMR-Experiments sind zwei Frequenzachsen, die eine chemische Verschiebung darstellen. Jede Frequenzachse ist mit einer der beiden Zeitvariablen verbunden, die die Länge der Evolutionsperiode sind (die Evolutionszeit) und die Zeit verstrichen während des Erkennungszeitraums (die Erkennungszeit). Sie werden jeweils von einer Zeitreihe in eine Frequenzreihe durch einen zweidimensionalen Umfang umgewandelt Fourier-Transformation. Ein einzelnes zweidimensionales Experiment wird als Reihe von eindimensionalen Experimenten mit einer anderen spezifischen Evolutionszeit in aufeinanderfolgenden Experimenten erzeugt, wobei die gesamte Dauer des Nachweiszeitraums in jedem Experiment aufgezeichnet wurde.[5]

Das Endergebnis ist ein Diagramm, das einen Intensitätswert für jedes Paar Frequenzvariablen zeigt. Die Intensitäten der Peaks im Spektrum können unter Verwendung einer dritten Dimension dargestellt werden. Häufiger wird die Intensität verwendet Umriss oder verschiedene Farben.

Homonukleare Durchbindungskorrelationsmethoden

Bei diesen Methoden tritt der Magnetisierungsübertragung zwischen Kern desselben Typs durch durch, durch J-Kopplung von Kernen, die durch bis zu wenige Bindungen verbunden sind.

Korrelationsspektroskopie (gemütlich)

In Standard -Gemütlichkeit bestehen die Vorbereitung (P1) und Mischung (P2) jeweils aus einem einzelnen 90 ° -Puls, der durch die Evolutionszeit T1 getrennt ist, und das Resonanzsignal aus der Probe wird während des Nachweiszeitraums über einen Bereich von T2 gelesen.

Das erste und beliebteste zweidimensionale NMR-Experiment ist die homonukleare Korrelationsspektroskopie-Sequenz (Cosy), die verwendet wird, um Spins zu identifizieren, die miteinander gekoppelt sind. Es besteht aus einem einzelnen HF -Impuls (P1), gefolgt von der spezifischen Evolutionszeit (T1), gefolgt von einem zweiten Impuls (P2), gefolgt von einer Messzeit (T2).[6]

Das zweidimensionale Spektrum, das aus dem gemütlichen Experiment resultiert Isotop, am häufigsten Wasserstoff (1H) entlang beiden Achsen. (Techniken wurden auch zur Erzeugung heteronukleärer Korrelationsspektren entwickelt, bei denen die beiden Achsen verschiedenen Isotopen entsprechen, wie z. 13C und 1H.) Diagonale Peaks entsprechen den Peaks in einem 1D-NMR-Experiment, während die Kreuzpeaks Kopplungen zwischen Kernenpaaren anzeigen (so viel wie die Multiplett-Spaltung der Kopplungen in 1D-NMR angibt).[6]

Cross Peaks resultieren aus einem Phänomen genannt Magnetisierungsübertragungund ihre Anwesenheit weist darauf hin, dass zwei Kerne gekoppelt sind und die zwei verschiedenen chemischen Verschiebungen haben, die die Koordinaten des Kreuzpeaks ausmachen. Jede Kopplung ergibt zwei symmetrische Kreuzpeaks über und unter der Diagonale. Das heißt, ein Kreuzpeak tritt auf, wenn zwischen den Signalen des Spektrums entlang jeder der beiden Achsen bei diesen Werten eine Korrelation besteht. Eine einfache visuelle Möglichkeit, zu bestimmen, welche Kopplungen ein Kreuzpeak darstellt, besteht darin, den diagonalen Peak zu finden, der sich direkt über oder unter dem Kreuzpeak befindet, und den anderen diagonalen Peak, der sich direkt links oder rechts neben dem Kreuzpeak befindet. Die durch diese beiden diagonalen Peaks dargestellten Kerne sind gekoppelt.[6]

1H gemütliches Spektrum von Progesteron. Das Spektrum, das sowohl entlang der horizontalen als auch in vertikalen Achsen erscheint 1H -NMR -Spektrum. Der Großteil der Peaks tritt entlang der Diagonale auf, während Kreuzpeaks symmetrisch über und unter der Diagonale erscheinen.

Cosy-90 ist das häufigste gemütliche Experiment. In Coy-90 neigt der P1-Impuls den Kernspin um 90 °. Ein weiteres Mitglied der gemütlichen Familie ist Cosy-45. In Coy-45 wird ein 45 ° -Puls anstelle eines 90 ° -Puls für den zweiten Impuls, p2, verwendet. Der Vorteil eines Coy-45 besteht darin, dass die Diagonal-Peaks weniger ausgeprägt sind, was es einfacher macht, Cross-Peaks in der Nähe der Diagonale in einem großen Molekül zu erreichen. Zusätzlich die relativen Anzeichen der Kopplungskonstanten (siehe J-Kopplung#Größe der J-Kopplung) kann aus einem cosy-45-Spektrum aufgeklärt werden. Dies ist mit Cosy-90 nicht möglich.[7] Insgesamt bietet der CoSy-45 ein saubereres Spektrum, während der CoSy-90 empfindlicher ist.

Eine andere verwandte gemütliche Technik ist die doppelt quantenfilterte (DQF) gemütlich. DQF Cosy verwendet eine Kohärenzauswahlmethode wie Phasenradfahren oder gepulste Feldgradienten, die nur Signale aus Doppelquantumkohärenz verursachen, um ein beobachtbares Signal zu ergeben. Dies hat den Effekt, die Intensität der diagonalen Peaks zu verringern und ihre Linie von einem breiten "Dispersion" -Lineshape zu einem schärferen "Absorption" -Lineshape zu verändern. Es eliminiert auch diagonale Peaks aus ungekoppelten Kernen. Diese alle haben den Vorteil, dass sie ein saubereres Spektrum geben, in dem die diagonalen Peaks verhindert werden, die Kreuzspitzen zu verdecken, die in einem regelmäßigen gemütlichen Spektrum schwächer sind.[8]

Exklusive Korrelationsspektroskopie (Ökosy)

Hauptartikel: Exklusive Korrelationsspektroskopie


Gesamtkorrelationsspektroskopie (TOCSY)

Typische Tocsy -Werte für Aminosäuren

Das Tocsy -Experiment ähnelt dem gemütlichen Experiment, in dem die Querpeaks von gekoppelten Protonen beobachtet werden. Cross -Peaks werden jedoch nicht nur für Kerne beobachtet, die direkt gekoppelt sind, sondern auch zwischen Kernen, die durch eine Kette von Kopplungen verbunden sind. Dies macht es nützlich, um die größeren miteinander verbundenen Netzwerke von Spinkopplungen zu identifizieren. Diese Fähigkeit wird erreicht, indem sich eine sich wiederholende Reihe von Impulsen einfügt, die verursachen isotropes Mischen während der Mischzeit. Längere isotrope Mischzeiten führen dazu, dass sich die Polarisation durch immer mehr Bindungen ausbreitet.[9]

Bei Oligosacchariden ist jeder Zuckerreste ein isoliertes Spinsystem, sodass es möglich ist, alle Protonen eines bestimmten Zuckerrückstands zu unterscheiden. Eine 1D -Version von TOCSY ist ebenfalls verfügbar, und durch Bestrahlung eines einzelnen Protons kann der Rest des Spinsystems aufgedeckt werden. Die jüngsten Fortschritte in dieser Technik umfassen das 1D-CSSF (Chemical Shift Selective Filter) TOCSY-Experiment, das Spektren mit höherer Qualität erzeugt und die Kopplungskonstanten zuverlässig extrahiert und zur Bestimmung der Stereochemie verwendet werden können.

Tocsy wird manchmal als "homonukleare Hartmann -Hahn -Spektroskopie" (Hohaha) bezeichnet.[10]

Unglaubliches Natural-Fundanz-Doppelquantum-Transferexperiment (unzureichend)

Unzureichend ist eine Methode, die häufig verwendet wird, um zu finden 13C -Kopplungen zwischen benachbarten Kohlenstoffatomen. Weil die natürliche Fülle von 13C sind nur etwa 1%, nur etwa 0,01% der untersuchten Moleküle werden die beiden in der Nähe haben 13C -Atome, die für ein Signal in diesem Experiment benötigt werden. Korrelationsauswahlmethoden werden jedoch verwendet (ähnlich wie bei DQF -Gemütlichkeit), um zu verhindern 13C Atome, damit das Doppel 13C Signale können leicht behoben werden. Jedes gekoppelte Kernepaar ergibt ein Peakpaar am unzureichenden Spektrum, das beide dieselbe vertikale Koordinate aufweisen, was die Summe der chemischen Verschiebungen der Kerne ist; Die horizontale Koordinate jedes Peaks ist die chemische Verschiebung für jeden der Kerne getrennt.[11]

Heteronukleare Durchgangskorrelationsmethoden

Die heteronukleäre Korrelationsspektroskopie ergibt ein Signal, das auf der Kopplung zwischen den Kernen zweier verschiedener Typen basiert. Oft sind die beiden Kerne Protonen und ein anderer Kern (als "heteronukleus" bezeichnet). Aus historischen Gründen werden Experimente, die das Proton und nicht das Heteronukleus -Spektrum während des Nachweiszeitraums aufzeichnen, als "inverse" Experimente bezeichnet. Dies liegt daran, dass die niedrige natürliche Häufigkeit der meisten Heteronuklei dazu führen würde, dass das Protonenspektrum mit Signalen von Molekülen ohne aktive Heteronuklei überwältigt wird, was es nutzlos macht, die gewünschten, gekoppelten Signale zu beobachten. Mit dem Aufkommen von Techniken zur Unterdrückung dieser unerwünschten Signale sind inverse Korrelationsexperimente wie HSQC, HMQC und HMBC heute tatsächlich viel häufiger. "Normale" heteronukleäre Korrelationsspektroskopie, bei der das Hetronukleus -Spektrum aufgezeichnet wird, wird als Hetcor bezeichnet.[12]

Heteronukleäre Einzelquantum-Korrelationsspektroskopie (HSQC)

1H-15N HSQC-Spektrum eines Fragments des Proteins NLEG3-2. Jeder Peak im Spektrum repräsentiert ein gebundenes NH -Paar, wobei seine beiden Koordinaten den chemischen Verschiebungen der einzelnen H- und N -Atome entsprechen. Einige der Peaks sind mit dem gekennzeichnet Aminosäure Rückstände, die dieses Signal verleihen.[13]
Hauptartikel: Heteronukleäre Einzelquantum-Korrelationsspektroskopie

HSQC erkennt Korrelationen zwischen Kernen zweier verschiedener Typen, die durch eine Bindung getrennt sind. Diese Methode ergibt einen Peak pro gekoppelter Kernepaar, dessen zwei Koordinaten die chemischen Verschiebungen der beiden gekoppelten Atome sind.[14]

HSQC arbeitet durch Übertragung der Magnetisierung von der I Kern (normalerweise das Proton) zum S Kern (normalerweise das Heteroatom) mit dem UNGESCHICKT Pulssequenz; Dieser erste Schritt erfolgt, weil das Proton eine größere Gleichgewichtsmagnetisierung aufweist und dieser Schritt ein stärkeres Signal erzeugt. Die Magnetisierung entwickelt sich dann und wird dann auf die zurückgeführt I Kern zur Beobachtung. Ein extra Spin -Echo Der Schritt kann dann optional verwendet werden, um das Signal zu entkoppeln und das Spektrum zu vereinfachen, indem Multipletts auf einen einzelnen Peak zusammenfallen. Die unerwünschten ungekoppelten Signale werden entfernt, indem das Experiment zweimal mit der Phase eines spezifischen Impulses umgekehrt wird. Dies kehrt die Vorzeichen der gewünschten, aber nicht der unerwünschten Peaks um, sodass die Subtraktion der beiden Spektren nur die gewünschten Peaks ergeben.[14]

Die heteronukleäre Mehrfachquantum-Korrelationsspektroskopie (HMQC) ergibt ein identisches Spektrum als HSQC, unter Verwendung einer anderen Methode. Die beiden Methoden liefern ähnliche Qualitätsergebnisse für kleine bis mittelgroße Moleküle, aber HSQC wird für größere Moleküle als überlegen angesehen.[14]

Heteronukleäre Mehrfachbindungskorrelationsspektroskopie (HMBC)

HMBC erkennt heteronukleäre Korrelationen über längere Bereiche von etwa 2–4 ​​Bindungen. Die Schwierigkeit, mehrere Bindungskorrelationen zu erkennen, besteht darin, dass die HSQC- und HMQC-Sequenzen eine spezifische Verzögerungszeit zwischen Impulsen enthalten, die die Erkennung nur eines Bereichs um eine bestimmte Kopplungskonstante ermöglicht. Dies ist kein Problem für die Einzelbindungsmethoden, da die Kopplungskonstanten dazu neigen, in einem engen Bereich zu liegen, aber mehrere Bindungskopplungskonstanten deckten einen viel größeren Bereich ab und können nicht alle in einem einzelnen HSQC- oder HMQC-Experiment erfasst werden.[15]

In HMBC wird diese Schwierigkeit überwunden, indem eine dieser Verzögerungen aus einer HMQC -Sequenz weggelassen wird. Dies erhöht den Bereich der Kopplungskonstanten, die erkannt werden können, und verringert auch den Signalverlust durch Relaxation. Die Kosten sind, dass dies die Möglichkeit der Entkopplung des Spektrums beseitigt und Phasenverzerrungen in das Signal einführt. Es gibt eine Modifikation der HMBC-Methode, die ein Bindungssignale unterdrückt und nur die Mehrfachbindungssignale hinterlässt.[15]

Durch-Raum-Korrelationsmethoden

Diese Methoden ermitteln Korrelationen zwischen Kernen, die physisch nahe beieinander liegen, unabhängig davon, ob zwischen ihnen eine Bindung besteht. Sie benutzen die Nuklearübersicht Effekt (NOE), durch das nahe gelegene Atome (innerhalb von etwa 5 Å) durch einen Mechanismus zu einer Kreuzrelaxation unterzogen werden Spin -Lattice -Entspannung.

Nuklearüberschließer -Effektspektroskopie (Noesy)

In Noesy wird der nukleare Überhelden überschritten, wie sich die Kernspins während der Mischperiode befindet, um die Korrelationen zu etablieren. Das erhaltene Spektrum ähnelt gemütlich mit diagonalen Peaks und Kreuzpeaks. Die Kreuzpeaks verbinden jedoch Resonanzen aus Kernen, die räumlich nahe sind als diejenigen, die durch Bindungen gekoppelt sind. Noesy -Spektren enthalten auch zusätzliche Axiale Peaks die keine zusätzlichen Informationen liefern und durch Umkehr der Phase des ersten Impulses durch ein anderes Experiment eliminiert werden können.[16]

Eine Anwendung von Noesy ist in der Untersuchung großer Biomoleküle wie in Protein NMR, in denen Beziehungen oft mit Verwendung zugeordnet werden können sequenzielles Gehen.

Das Noesy-Experiment kann auch auf eindimensionale Weise durchgeführt werden, indem einzelne Resonanzen vorgewählt werden. Die Spektren werden mit den vorgewählten Kernen gelesen, die ein großes, negatives Signal geben, während benachbarte Kerne durch schwächere, positive Signale identifiziert werden. Dies zeigt nur, welche Peaks messbare NOEs für die Resonanz von Interesse haben, dauert jedoch viel weniger Zeit als das vollständige 2D -Experiment. Wenn ein vorgewählter Kern die Umgebung innerhalb der Zeitskala des Experiments verändert, können mehrere negative Signale beobachtet werden. Dies bietet Austauschinformationen ähnlich der EXSy (Exchange Specroscopy) NMR -Methode.

Noesy -Experimente sind ein wichtiges Werkzeug, um die Stereochemie eines Moleküls in Lösungsmittel zu identifizieren, während ein einzelner Kristall -XRD zur Identifizierung der Stereochemie eines Moleküls in fester Form verwendet wird.

Dreh- und Rahmenkernüberbezeichnungseffektspektroskopie (Roesy)

Roesy ähnelt Noesy, außer dass der Anfangszustand unterschiedlich ist. Anstatt die Kreuzungspreisung aus einem anfänglichen Zustand von zu beobachten z-Magnetisierung wird die Gleichgewichtsmagnetisierung auf die gedreht x Achse und dann von einem externen Magnetfeld spinnen, damit es nicht vorhaben kann. Diese Methode ist nützlich für bestimmte Moleküle, deren Rotationskorrelationszeit fällt in einen Bereich, in dem der nuklearen Überhelden -Effekt zu schwach ist, um nachweisbar zu sein, normalerweise Moleküle mit a Molekulargewicht ungefähr 1000 Daltons, weil Roesy eine andere Abhängigkeit zwischen der Korrelationszeit und der Kreuzrelaxationsrate hat. In der Noesy geht die Kreuzrelaxationsrate konstant von positiv zu negativ, wenn die Korrelationszeit zunimmt, was einen Bereich ergibt, in dem sie nahe Null ist, während in Roesy die Kreuzrelaxationsrate immer positiv ist.[17][18]

Roesy wird manchmal als "Kreuzrelaxation für Minimoleküle geeignet, die durch verschlossene Spins" (CAMELSPIN) geeignet sind.[18]

Auflösungsspektrum

Im Gegensatz zu korrelierten Spektren verteilten aufgelöste Spektren die Peaks in einem 1D-NMR-Experiment in zwei Dimensionen, ohne zusätzliche Peaks hinzuzufügen. Diese Methoden werden normalerweise als J-aufgelöste Spektroskopie bezeichnet, werden jedoch manchmal auch als chemische Verschiebung bezeichnet, die Spektroskopie oder Δ-aufgelöste Spektroskopie bezeichnet. Sie sind nützlich, um Moleküle zu analysieren, bei denen die 1D-NMR-Spektren überlappende Multiplets enthalten, wenn das J-aufgelöste Spektrum die Multiplett von jedem Kern um eine andere Menge vertikal verdrängt. Jeder Peak im 2D-Spektrum hat die gleiche horizontale Koordinate wie in einem nicht entkoppelten 1D-Spektrum, aber seine vertikale Koordinate ist die chemische Verschiebung des einzelnen Peaks, den der Kern in einem entkoppelten 1D-Spektrum hat.[19]

Für die heteronukleäre Version wird die einfachste verwendete Impulsequenz als Müller -Kumar -Er -Er -ERNST (MKE) -Experiment bezeichnet, das für die Vorbereitungsperiode einen einzelnen 90 ° -Puls für das Heteronukleus für die Vorbereitungsperiode aufweist, und ein Entkopplungssignal auf das Proton angewendet wird während der Erkennungsperiode. Es gibt mehrere Varianten in dieser Impulsequenz, die empfindlicher und genauerer sind, die unter die Kategorien von fallen Gated -Entkopplungsmethoden und Spin-Flip-Methoden. Homonukleare J-aufgelöste Spektroskopie verwendet die Spin -Echo Pulssequenz.[19]

Höherdimensionale Methoden

3D- und 4D -Experimente können auch durchgeführt werden, manchmal durch Ausführen der Impulsequenzen aus zwei oder drei 2D -Experimenten in Reihe. Viele der häufig verwendeten 3D -Experimente sind jedoch Dreifachresonanzexperimente; Beispiele sind die Hnca und HNCOCA -Experimente, die oft in verwendet werden in Protein NMR.

Siehe auch

Verweise

  1. ^ Auue, W. P.; Bartholdi, E.; Ernst, R. R. (1976). "Zweidimensionale Spektroskopie. Anwendung auf Kernmagnetresonanz". Journal of Chemical Physics. 64 (5): 2229–46. Bibcode:1976jchph..64.2229a. doi:10.1063/1.432450.
  2. ^ Martin, G. E.; Zekter, A. S. (1988). Zweidimensionale NMR-Methoden zur Herstellung molekularer Konnektivität. New York: VCH Publishers, Inc. p.59.
  3. ^ MateSecu, Gheorghe D.; Valeriu, Adrian (1993). 2D -NMR -Dichtematrix und Produktbetreiberbehandlung. Englewood Cliffs, New Jersey: PTR Prentice Hall.
  4. ^ Akitt, J. W.; Mann, B. E. (2000). NMR und Chemie. Cheltenham, Großbritannien: Stanley Thornes. p. 273.
  5. ^ a b Keeler, James (2010). Verständnis der NMR -Spektroskopie (2. Aufl.). Wiley. S. 184–187. ISBN 978-0-470-74608-0.
  6. ^ a b c Keeler, S. 190–191.
  7. ^ Akitt & Mann, p. 287.
  8. ^ Keeler, S. 199–203.
  9. ^ Keeler, S. 223–226.
  10. ^ "2d: Homonukleare Korrelation: Tocsy". Queen's University. Archiviert von das Original am 27. September 2011. Abgerufen 26. Juni 2011.
  11. ^ Keeler, S. 206–208.
  12. ^ Keeler, S. 208–209, 220.
  13. ^ Wu, Bin; Skarina, Tatiana; Yee, Adelinda; Jobin, Marie-Claude; Dileo, Rosa; Semesi, Anthony; et al. (Juni 2010). "NLEG Typ 3 -Effektoren von Enterohaemorrhagic Escherichia coli Sind U-Box E3 Ubiquitin-Ligasen ". PLOS -Krankheitserreger. 6 (6): e1000960. doi:10.1371/journal.ppat.1000960. PMC 2891834. PMID 20585566.
  14. ^ a b c Keeler, S. 209–215.
  15. ^ a b Keeler, S. 215–219.
  16. ^ Keeler, S. 274, 281–284.
  17. ^ Keeler, S. 273, 297–299.
  18. ^ a b Nakanishi, Koji, hrsg. (1990). Eindimensionale und zweidimensionale NMR-Spektren durch moderne Impulstechniken. Mill Valley, Kalifornien: Universitätswissenschaftsbücher. p. 136. ISBN 0-935702-63-6.
  19. ^ a b Schraml, Jan; Bellama, Jon M. (1988). Zweidimensionale NMR-Spektrocopie. New York: Wiley. pp.28–33, 49–50, 65. ISBN 0-471-60178-0.