Spektrophotometrie

Tabellen-Top-Spektrophotometer
Beckman IR-1-Spektrophotometer, ca. 1941
Beckman Model DB -Spektrophotometer (ein Doppelstrahlmodell), 1960
Handheld-Spektrophotometer in der Grafikindustrie verwendet[1]

Spektrophotometrie ist ein Zweig von elektromagnetische Spektroskopie befasst sich mit der quantitativen Messung der Reflexions- oder Übertragungseigenschaften eines Materials als Funktion der Wellenlänge.[2] Die Spektrophotometrie verwendet Fotometer, bekannt als Spektrophotometer, die die Intensität eines Lichtstrahls bei verschiedenen Wellenlängen messen können. Obwohl die Spektrophotometrie am häufigsten auf Ultraviolett angewendet wird, wird es am häufigsten angewendet sichtbar, und Infrarot Strahlung, moderne Spektrophotometer können weite Schwaden der Befragung des elektromagnetisches Spektrum, einschließlich Röntgen, Ultraviolett, sichtbar, Infrarotund/oder Mikrowelle Wellenlängen.

Überblick

Die Spektrophotometrie ist ein Werkzeug, das die quantitative Analyse von Molekülen abhängt, je nachdem, wie viel Licht von farbigen Verbindungen absorbiert wird. Wichtige Merkmale von Spektrophotometern sind die Spektralbandbreite (der Farbbereich, den sie durch die Testprobe übertragen kann), der Prozentsatz der Probenübertragung, der logarithmische Bereich der Probenabsorption und manchmal einen Prozentsatz der Reflexionsmessung.

Ein Spektrophotometer wird üblicherweise für die Messung der Sendung oder des Reflexionsvermögens von Lösungen, transparenten oder undurchsichtigen Feststoffen wie poliertem Glas oder Gasen verwendet. Obwohl viele Biochemikalien wie in gefärbt sind, absorbieren sie sichtbares Licht und können daher durch kolorimetrische Verfahren gemessen werden, sogar farblose Biochemikalien können häufig in farbige Verbindungen umgewandelt werden, die für chromogene farbbildende Reaktionen geeignet sind, um Verbindungen zu erhalten, die für die kolorimetrische Analyse geeignet sind.[3]: 65 Sie können jedoch auch so konzipiert werden, dass sie die messen Diffusivität Auf einem der aufgelisteten Lichtbereiche, die normalerweise rund 200–2500 nm mit verschiedenen Steuerelementen abdecken und Kalibrierungen.[2] Innerhalb dieser Lichtbereiche werden Kalibrierungen auf der Maschine unter Verwendung von Standards benötigt, die je nach Typ variieren Wellenlänge des Photometrische Bestimmung.[4]

Ein Beispiel für ein Experiment, bei dem die Spektrophotometrie zur Bestimmung der Gleichgewichtskonstante einer Lösung verwendet wird. Eine bestimmte chemische Reaktion innerhalb einer Lösung kann in Vorwärts- und Rückwärtsrichtung auftreten, in der Reaktanten Produkte und Produkte in Reaktanten bilden. Irgendwann erreicht diese chemische Reaktion einen Gleichgewichtspunkt, der als Gleichgewichtspunkt bezeichnet wird. Um die jeweiligen Konzentrationen von Reaktanten und Produkten an diesem Punkt zu bestimmen, kann die Lichtübertragung der Lösung unter Verwendung der Spektrophotometrie getestet werden. Die Lichtmenge, die durch die Lösung fließt, weist auf die Konzentration bestimmter Chemikalien hin, die es nicht durch das Licht durchlaufen lassen.

Die Absorption von Licht ist auf die Wechselwirkung von Licht mit den elektronischen und Schwingungsmodi von Molekülen zurückzuführen. Jede Art von Molekül hat einen einzelnen Satz von Energieniveaus, die mit dem Zusammensetzung seiner chemischen Bindungen und Kerne assoziiert sind, und absorbiert somit das Licht spezifischer Wellenlängen oder Energien, was zu einzigartigen spektralen Eigenschaften führt.[5] Dies basiert auf seinem spezifischen und unterschiedlichen Make -up.

Die Verwendung von Spektrophotometern umfasst verschiedene wissenschaftliche Bereiche, wie z. Physik, Materialwissenschaften, Chemie, Biochemie, Chemieingenieurwesen, und Molekularbiologie.[6] Sie werden in vielen Branchen häufig verwendet, darunter Halbleiter, Laser- und optische Herstellung, Druck- und forensische Untersuchung sowie in Laboratorien zur Untersuchung chemischer Substanzen. Spektrophotometrie wird häufig bei Messungen der Enzymaktivitäten, Bestimmungen der Proteinkonzentrationen, Bestimmungen von enzymatischen kinetischen Konstanten und Messungen von Ligandenbindungsreaktionen verwendet.[3]: 65 Letztendlich kann ein Spektrophotometer je nach Kontrolle oder Kalibrierung bestimmen, welche Substanzen in einem Ziel vorhanden sind und wie viel durch Berechnungen beobachteter Wellenlängen.

Im AstronomieDer Begriff Spektrophotometrie bezieht sich auf die Messung des Spektrums von a Himmelsobjekt in welcher Fluss Die Skala des Spektrums wird als Funktion von kalibriert Wellenlängenormalerweise im Vergleich zu einer Beobachtung eines spektrophotometrischen Standardsterns und korrigiert für die Absorption des Lichts durch die Erdatmosphäre.[7]

Geschichte

Erfunden von Arnold O. Beckman 1940[umstritten – diskutieren]Das Spektrophotometer wurde mit Hilfe seiner Kollegen in seinem Unternehmen National Technical Laboratories gegründet, die 1935 gegründet wurden und die Beckman -Instrumentenfirma und letztendlich werden würden Beckman Coulter. Dies würde eine Lösung für die zuvor erstellten Spektrophotometer sein, die das Ultraviolett nicht richtig absorbieren konnten. Er würde mit der Erfindung von Modell A beginnen, bei dem ein Glasprisma verwendet wurde, um das UV -Licht zu absorbieren. Es würde sich herausstellen, dass dies keine zufriedenstellenden Ergebnisse lieferte. Daher gab es in Modell B eine Verschiebung von einem Glas zu einem Quarzprisma, das eine bessere Absorptionsgebnisse ermöglichte. Von dort aus wurde Modell C mit einer Anpassung an die Wellenlängenauflösung geboren, die schließlich drei Einheiten davon produzierte. Das letzte und beliebteste Modell wurde Modell D, das jetzt besser als das anerkannt wird DU -Spektrophotometer Dies enthielt das Instrumentenfall, die Wasserstofflampe mit ultraviolettem Kontinuum und einen besseren Monochromator.[8] Es wurde von 1941 bis 1976 produziert, wo der Preis dafür 1941 war US$723 (Far-UV-Zubehör war eine Option zu zusätzlichen Kosten). Mit den Worten von Nobelchemie -Laureate Bruce MerrifieldEs war "wahrscheinlich das wichtigste Instrument, das jemals für die Weiterentwicklung der Bioscience entwickelt wurde".[9]

Sobald es 1976 eingestellt wurde,[10] Hewlett Packard Erstellte 1979 das erste im Handel erhältliche Dioden-Array-Spektrophotometer als HP 8450A.[11] Dioden-Array-Spektrophotometer unterschieden sich vom ursprünglichen Spektrophotometer von Beckman, da es sich um das erste Einzelstrahl-Mikroprozessor-kontrollierte Spektrophotometer mit Mikroprozessoren handelte, das mehrere Wellenlängen gleichzeitig in Sekundenpunkten scannte. Es bestrahlt die Probe mit polychromatischem Licht, das die Probe in Abhängigkeit von ihren Eigenschaften absorbiert. Dann wird es durch Gitter des Fotodiodenarrays übertragen, das den Wellenlängenbereich des Spektrums erkennt.[12] Seitdem hat sich die Schaffung und Implementierung von Spektrophotometriegeräten immens erhöht und ist zu einem der innovativsten Instrumente unserer Zeit geworden.

Entwurf

Einzelstrahl-Scan-Spektrophotometer

Es gibt zwei Hauptklassen von Geräten: Einzelstrahl und Doppelstrahl. Ein Doppelstrahlspektrophotometer[13] Vergleicht die Lichtintensität zwischen zwei Lichtpfaden, einem Pfad, der eine Referenzprobe enthält, und die andere die Testprobe. Ein Einzelstrahlspektrophotometer misst die relative Lichtintensität des Strahls vor und nach Einführung einer Testprobe. Obwohl Vergleichsmessungen von Doppelstrahlinstrumenten einfacher und stabiler sind, können Einzelstrahlinstrumente einen größeren Dynamikbereich aufweisen und optisch einfacher und kompakter sind. Darüber hinaus einige spezialisierte Instrumente, wie z. B. Spektrophotometer aufgebaut Mikroskope oder Teleskope sind aufgrund von Praktikabilität Einstrahlinstrumente.

Historisch gesehen verwenden Spektrophotometer a Monochromator enthält a Beugungsgitter zum Herstellen des analytischen Spektrums. Das Gitter kann entweder beweglich oder fest sein. Wenn ein einzelner Detektor, wie a Fotomultiplikatorröhre oder Fotodiode Wird verwendet, kann das Gitter schrittweise gescannt werden (Scan -Spektrophotometer), so dass der Detektor die Lichtintensität bei jeder Wellenlänge messen kann (was jedem "Schritt" entspricht). Arrays von Detektoren (Array -Spektrophotometer), wie z. Gebühren gekoppelte Geräte aufladen (CCD) oder Fotodiodenarrays (PDA) kann auch verwendet werden. In solchen Systemen wird das Gitter festgelegt und die Intensität jeder Lichtwellenlänge durch einen anderen Detektor im Array gemessen. Darüber hinaus verwenden die meisten modernen Mittelinfrarot-Spektrophotometer a Fourier-Transformation Technik zum Erwerb der spektralen Informationen. Diese Technik heißt Fourier -Transformationsinfrarotspektroskopie.

Bei Übertragungsmessungen vergleicht das Spektrophotometer quantitativ den Lichtanteil, der eine Referenzlösung und eine Testlösung durchläuft, die Intensitäten der beiden Signale elektronisch vergleicht und den Prozentsatz der Übertragung der Probe im Vergleich zum Referenzstandard berechnet. Für Reflexionsmessungen vergleicht das Spektrophotometer quantitativ den Lichtanteil, der sich aus den Referenz- und Testproben widerspiegelt. Licht aus der Quellenlampe wird durch einen Monochromator geleitet, der das Licht in einen "Regenbogen" von Wellenlängen durch ein rotierendes Prisma beendet und schmale Bandbreiten dieses gebeuten Spektrums durch einen mechanischen Schlitz auf der Ausgangsseite des Monochromators ausgibt. Diese Bandbreiten werden durch die Testprobe übertragen. Dann wird die Photonenflussdichte (normalerweise quadratische Watt pro Meter) des übertragenen oder reflektierten Lichts mit einer Fotodiode gemessen. Laden Sie gekoppeltes Gerät oder andere Lichtsensor. Das Durchlässigkeit oder Reflexionsvermögen Der Wert für jede Wellenlänge der Testprobe wird dann mit den Übertragungs- oder Reflexionswerten aus der Referenzprobe verglichen. Die meisten Instrumente wenden eine logarithmische Funktion auf das lineare Transmissionsverhältnis an, um die "Absorption" der Probe zu berechnen, ein Wert, der proportional zur "Konzentration" der gemessenen Chemikalie ist.

Kurz gesagt, die Abfolge von Ereignissen in einem Scan -Spektrophotometer lautet wie folgt:

  1. Die Lichtquelle wird in einen Monochromator geleuchtet, in einen Regenbogen gebeugt und in zwei Strahlen aufgeteilt. Es wird dann durch die Probe und die Referenzlösungen gescannt.
  2. Die Fraktionen der einfallenden Wellenlängen werden durch die Probe und die Referenz übertragen oder sich daraus widerspiegeln.
  3. Das resultierende Licht schlägt die Fotodetektor Gerät, das die relative Intensität der beiden Strahlen vergleicht.
  4. Elektronische Schaltkreise wandeln die relativen Ströme in lineare Übertragungsprozentsätze und/oder die Absorptions-/Konzentrationswerte um.

In einem Array -Spektrophotometer lautet die Sequenz wie folgt:[14]

  1. Die Lichtquelle wird in die Probe gerichtet und in einen Schlitz konzentriert
  2. Das übertragene Licht wird in einen Regenbogen mit dem Reflexionsgitter gebrochen
  3. Das resultierende Licht trifft auf das Fotodetektorgerät, das die Intensität des Strahls vergleicht
  4. Elektronische Schaltkreise wandeln die relativen Ströme in lineare Übertragungsprozentsätze und/oder Absorptions-/Konzentrationswerte um

Viele ältere Spektrophotometer müssen durch ein als "Nullpunkt" bezeichnetes Verfahren kalibriert werden, um den Nullstromausgang der beiden Strahlen am Detektor auszugleichen. Die Übertragung eines Referenzsubstanz wird als Basis (DATUM) -Wert eingestellt, sodass die Übertragung aller anderen Substanzen relativ zum anfänglichen "Null -Substanz" aufgezeichnet wird. Das Spektrophotometer wandelt dann das Transmissionsverhältnis in "Absorption" um, wobei die Konzentration spezifischer Komponenten der Testprobe relativ zur anfänglichen Substanz.[6]

Bewerbungen in der Biochemie

Die Spektrophotometrie ist eine wichtige Technik, die in vielen biochemischen Experimenten verwendet wird, die DNA-, RNA- und Proteinisolierung, Enzymkinetik und biochemische Analysen beinhalten.[15] Da Stichproben in diesen Anwendungen in großen Mengen nicht ohne weiteres verfügbar sind, sind sie besonders für diese nicht zerstörerische Technik geeignet. Darüber hinaus kann eine kostbare Probe mit einer Mikrovolumenplattform gespeichert werden, auf der für vollständige Analysen nur 1ul Probe erforderlich ist.[16] Eine kurze Erklärung des Verfahrens der Spektrophotometrie umfasst das Vergleich der Absorption einer leeren Probe, die keine farbige Verbindung mit einer Probe enthält, die eine farbige Verbindung enthält. Diese Färbung kann entweder durch einen Farbstoff wie Coomasie Brilliant Blue G-250-Farbstoff mit 595 nm oder durch eine enzymatische Reaktion zwischen β-Galactosidase und ONPG (Kurvenprobe gelb) erreicht werden, gemessen bei 420 nm.[3]: 21–119 Das Spektrophotometer wird verwendet, um farbige Verbindungen im sichtbaren Lichtbereich (zwischen 350 nm und 800 nm) zu messen.[3]: 65 Daher kann es verwendet werden, um weitere Informationen über die untersuchte Substanz zu finden. In biochemischen Experimenten wird eine chemische und/oder physikalische Eigenschaft ausgewählt, und das verwendete Verfahren ist spezifisch für diese Eigenschaft, um weitere Informationen über die Probe abzuleiten, wie z. B. die Menge, Reinheit, Enzymaktivität usw. können verwendet werden Für eine Reihe von Techniken wie die Bestimmung der optimalen Wellenlängenabsorption von Proben, die Bestimmung des optimalen pH -Werts für die Absorption von Proben, das Bestimmen der Konzentrationen unbekannter Proben und das Bestimmen der PKA verschiedener Proben.[3]: 21–119 Die Spektrophotometrie ist auch ein hilfreicher Prozess für die Proteinreinigung[17] und kann auch als Methode verwendet werden, um optische Tests einer Verbindung zu erstellen. Spektrophotometrische Daten können auch in Verbindung mit der Bier -Lambert -Gleichung verwendet werden. um verschiedene Beziehungen zwischen Transmission und Konzentration und Absorption und Konzentration zu bestimmen.[3]: 21–119 Da ein Spektrophotometer die Wellenlänge einer Verbindung durch ihre Farbe misst, kann eine Farbstoffbindungssubstanz hinzugefügt werden, damit sie sich einer Farbänderung unterziehen und gemessen werden kann.[18] Es ist möglich, die Konzentrationen eines zwei Komponentengemisches unter Verwendung der Absorptionsspektren der Standardlösungen jeder Komponente zu kennen. Dazu ist es notwendig, den Aussterbenkoeffizienten dieser Mischung bei zwei Wellenlängen und die Aussterbenkoeffizienten von Lösungen zu kennen, die die bekannten Gewichte der beiden Komponenten enthalten.[19] Zusätzlich zum traditionellen Bier-Lamberts-Rechtsmodell kann die freie Spektroskopie basierender Kennzeichnung verwendet werden, die einen optischen Filter in den Lichtwegen hinzufügen, sodass das Spektrophotometer Konzentration, Größe und Brechungsindex von Proben nach dem Händegesetz quantifizieren kann.[20] Spektrophotometer wurden über Jahrzehnte entwickelt und verbessert und bei Chemikern weit verbreitet. Zusätzlich sind Spektrophotometer speziell, um entweder UV- oder sichtbare Lichtwellenlänge -Absorptionswerte zu messen.[3]: 21–119 Es wird als sehr genaues Instrument angesehen, das auch sehr empfindlich und daher äußerst präzise ist, insbesondere bei der Bestimmung der Farbänderung.[21] Diese Methode eignet sich auch für die Verwendung in Laborversuche, da es sich um einen kostengünstigen und relativ einfachen Prozess handelt.

UV-sichtbare Spektrophotometrie

Hauptartikel: Ultraviolett-sichtbare Spektroskopie

Die meisten Spektrophotometer werden in der verwendet UV und sichtbar Regionen des Spektrums und einige dieser Instrumente arbeiten ebenfalls in der Nähe.Infrarot Region auch. Die Konzentration eines Proteins kann durch Messen des OD bei 280 nm aufgrund des Vorhandenseins von Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin geschätzt werden. Diese Methode ist nicht sehr genau, da die Zusammensetzung von Proteinen stark variiert und Proteine ​​ohne diese Aminosäuren bei 280 nm keine maximale Absorption aufweisen. Die Nukleinsäureverschmutzung kann ebenfalls stören. Diese Methode erfordert ein Spektrophotometer, das in der UV -Region mit Quarzkuvetten messen kann.[3]: 135

Die ultraviolett-sichtbare (UV-Vis-) Spektroskopie umfasst Energieniveaus, die elektronische Übergänge hervorrufen. Die Absorption von UV-Vis-Licht erregt Moleküle, die in Bodenstaaten zu ihren angeregten Status sind.[5]

Die sichtbare Region 400–700 nm Spektrophotometrie wird in großem Umfang in verwendet Colorimetrie Wissenschaft. Es ist bekannt, dass es am besten im Bereich von 0,2–0,8 O.D. Tintenhersteller, Druckunternehmen, Textilanbieter und vieles mehr benötigen die Daten, die durch Colorimetrie bereitgestellt werden. Sie nehmen Lesungen in der Region von jeweils 5 bis 20 Nanometern entlang der sichtbaren Region und produzieren a Spektralreflektion Kurve oder Datenstrom für alternative Präsentationen. Diese Kurven können verwendet werden, um eine neue Farbstapel zu testen, um zu überprüfen, ob sie mit den Spezifikationen übereinstimmen, z. B. ISO -Druckstandards.

Herkömmliche Spektrophotometer für sichtbare Region können nicht feststellen, ob ein Farbmittel oder das Grundmaterial Fluoreszenz aufweist. Dies kann es schwierig machen, Farbprobleme zu verwalten, wenn zum Beispiel ein oder mehrere der Drucktinten fluoreszierend sind. Wenn ein Farbton Fluoreszenz enthält, wird ein bispektrales fluoreszierendes Spektrophotometer verwendet. Es gibt zwei Hauptaufbauten für visuelle Spektrumspektrophotometer, D/8 (sphärisch) und 0/45. Die Namen sind auf die Geometrie der Lichtquelle, des Beobachters und des Innenraums der Messkammer zurückzuführen. Wissenschaftler verwenden dieses Instrument, um die Menge der Verbindungen in einer Probe zu messen. Wenn die Verbindung konzentrierter ist, wird mehr Licht von der Probe absorbiert; Innerhalb kleiner Bereiche die Bier -Lambert -Gesetz haltet und die Absorption zwischen den Proben variiert linear mit der Konzentration. Bei Druckmessungen werden zwei alternative Einstellungen üblicherweise verwendet- ohne/mit UV-Filter, um die Auswirkung von UV-Aufhellern im Papierbestand besser zu kontrollieren.

Mettler Toledo UV5Nano-Mikrovolumenspektrophotometer

Proben werden normalerweise in vorbereitet in Cuvetten; Abhängig von der Interessenregion können sie konstruiert werden Glas, Plastik (sichtbare Spektrumregion von Interesse) oder Quarz (FAR UV -Spektrumregion von Interesse). Einige Anwendungen erfordern kleine Volumenmessungen, die mit Mikrovolumenplattformen durchgeführt werden können.

Anwendungen

Experimentelle Anwendung

Wie im Anwendungsabschnitt beschrieben, kann die Spektrophotometrie sowohl in der qualitativen als auch in der quantitativen Analyse von DNA, RNA und Proteinen verwendet werden. Eine qualitative Analyse kann verwendet werden, und Spektrophotometer werden verwendet, um Spektren von Verbindungen durch Scannen breiter Wellenlängenbereiche aufzuzeichnen, um die Absorptionseigenschaften (die Intensität der Farbe) der Verbindung bei jeder Wellenlänge zu bestimmen.[5] Ein Experiment, das die verschiedenen Verwendungen demonstrieren kann, die sichtbare Spektrophotometrie haben kann, ist die Trennung von β-Galactosidase von einem Gemisch verschiedener Proteine. Vor allem wird die Spektrophotometrie am besten verwendet, um die Reinigungsmenge zu quantifizieren, die Ihre Stichprobe im Vergleich zur Gesamtproteinkonzentration unterzogen hat. Durch das Ausführen einer Affinitätschromatographie kann B-Galactosidase isoliert und getestet werden, indem gesammelte Proben mit ONPG reagiert und festgelegt werden, ob die Probe gelb wird.[3]: 21–119 Nach diesem Testen der Stichprobe bei 420 nm für eine spezifische Wechselwirkung mit ONPG und bei 595 für einen Bradford -Assay kann die Reinigung quantitativ bewertet werden.[3]: 21–119 Zusätzlich zu dieser Spektrophotometrie kann zusammen mit anderen Techniken wie SDS-PAGE-Elektrophorese verwendet werden, um verschiedene Proteinproben zu reinigen und zu isolieren.

IR -Spektrophotometrie

Hauptartikel: Infrarot-Spektroskopie

Die für die Infrarotregion entwickelten Spektrophotometer unterscheiden sich aufgrund der technischen Messanforderungen in dieser Region sehr unterschiedlich. Ein Hauptfaktor ist die Art von Photosensoren, die für verschiedene Spektralregionen verfügbar sind, aber auch die Infrarotmessung ist eine Herausforderung, da praktisch alles IR -Licht als thermische Strahlung abgibt, insbesondere bei Wellenlängen über etwa 5 μm.

Eine weitere Komplikation ist, dass einige Materialien wie Glas- und Kunststoff -Infrarotlicht absorbieren, was es als optisches Medium inkompatibel macht. Ideale optische Materialien sind Salze, die nicht stark absorbieren. Proben für IR -Spektrophotometrie können zwischen zwei Scheiben von verschmiert werden Kaliumbromid oder mit Kaliumbromid gemahlen und in ein Pellet gepresst. Wo wässrige Lösungen gemessen werden sollen, unlöslich Silberchlorid wird verwendet, um die Zelle zu konstruieren.

Spektroradiometer

Spektroradiometer, die fast wie die Spektrophotometer der sichtbaren Region arbeiten, sind so konzipiert, dass sie die messen sollen Spektraldichte von Beleuchtung. Die Anwendungen können die Bewertung und Kategorisierung der Beleuchtung für den Umsatz durch den Hersteller oder die Kunden, die die von ihnen entschiedene Lampe bestätigen, innerhalb ihrer Spezifikationen feststellen, umfassen. Komponenten:

  1. Die Lichtquelle scheint auf oder durch die Probe.
  2. Die Probe überträgt oder reflektiert Licht.
  3. Der Detektor erkennt, wie viel Licht aus der Probe reflektiert oder übertragen wurde.
  4. Der Detektor wandelt dann um, wie viel Licht die Probe übertragen oder in eine Zahl reflektiert hat.

Siehe auch

Verweise

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Externe Links