Einzelmolekül-Experiment

Einzelpolymermoleküle (0,4 nm dicke Ketten), die unter wässrigen Medien bei unterschiedlichem pH unter Verwendung eines aufgezeichnet wurden AFM. Die drastische Änderung der Polymerkettenkonformation wird bei einer geringen Änderung des pH -Werts beobachtet.[1]

A Einzelmolekül-Experiment ist ein Experiment, das die Eigenschaften des Einzelnen untersucht Moleküle. Einzelmolekülstudien können mit Messungen an einem Ensemble- oder Massensammlung von Molekülen kontrastiert werden, bei denen das individuelle Verhalten von Molekülen nicht unterschieden werden kann und nur Durchschnitt Eigenschaften können gemessen werden. Da viele Messtechniken in Biologie, Chemie und Physik nicht empfindlich genug sind, um einzelne Moleküle, Einzelmoleküle, zu beobachten Fluoreszenz Techniken (die sich seit den 1990er Jahren zur Untersuchung verschiedener Prozesse auf dem Niveau einzelner Moleküle entwickelt haben) verursachten viel Aufregung, da diese viele neue Details zu den gemessenen Prozessen lieferten, die in der Vergangenheit nicht zugänglich waren. In der Tat wurden seit den 1990er Jahren viele Techniken zur Prüfung einzelner Moleküle entwickelt.[2]

Die ersten Einzelmolekül-Experimente waren Patch -Klemme Experimente, die in den 1970er Jahren durchgeführt wurden, waren jedoch auf die Studie beschränkt Ionenkanäle. Zu den untersuchten Systemen, die unter Verwendung von Einzelmolekül-Techniken untersucht wurden, gehören die Bewegung von Myosin auf Aktinfilamente im Muskelgewebe und die spektroskopischen Details einzelner lokaler Umgebungen in Festkörpern. Die Konformationen von biologischen Polymeren wurden unter Verwendung gemessen Rasterkraftmikroskopie (AFM). Verwendung Kraftspektroskopie, einzelne Moleküle (oder Paare interagierender Moleküle), normalerweise Polymere, kann mechanisch gestreckt und ihre elastische Reaktion in Echtzeit aufgezeichnet werden.

Geschichte

In der Gasphase bei Ultralow-Druck gibt W. E. Moerner und Lothar Kador.[3] Ein Jahr später konnten Michel Orrit und Jacky Bernard auch den Nachweis der Absorption einzelner Moleküle durch ihre Fluoreszenz zeigen.[4]

Viele Techniken haben die Fähigkeit, jeweils ein Molekül zu beobachten Massenspektrometer, wo einzelne Ionen erkannt werden. Zusätzlich kam eines der frühesten Mittel, um einzelne Moleküle zu erkennen, auf dem Gebiet von Ionenkanäle mit der Entwicklung der Patch -Klemme Technik von Erwin Neher und Bert Sakmann (der später den Nobelpreis für ihre wegweisenden Beiträge gewann). Die Idee der Messung der Leitfähigkeit, um einzelne Moleküle zu untersuchen, legte jedoch eine ernsthafte Einschränkung der Art der Systeme, die beobachtet werden konnten.

Fluoreszenz ist ein bequemes Mittel, um jeweils ein Molekül zu beobachten, hauptsächlich aufgrund der Empfindlichkeit kommerzieller optischer Detektoren, die einzelne Photonen zählen können. Spektroskopisch erfordert die Beobachtung eines Moleküls, dass sich das Molekül in einer isolierten Umgebung befindet und bei der Anregung Photonen emittiert, was aufgrund der Technologie, einzelne Photonen mithilfe von Photomultiplikatorrohre (PMT) oder Avalanche -Photodiden (APD), zu erfassen, und ausgibt Ermöglicht es einem, Photonemissionsereignisse mit großer Empfindlichkeit und zeitlicher Auflösung aufzunehmen.

In jüngerer Zeit ist die Fluoreszenz von Einzelmolekül durch die Markierung von Biomolekülen wie Proteinen und Nukleotiden, um die enzymatische Funktion zu untersuchen, die auf der Massenskala nicht leicht untersucht werden kann und strukturelle Reorganisation. Das am meisten untersuchte Protein war die Klasse von Myosin/Actin -Enzymen, die in Muskelgeweben gefunden wurden. Durch Einzelmolekül-Techniken wurde der Schrittmechanismus beobachtet und in vielen dieser Proteine ​​charakterisiert.

Nanomanipulatoren wie die Atomkraftmikroskop sind auch für Einzelmolekül-Experimente von biologischer Bedeutung geeignet, da sie auf derselben Längenskala der meisten biologischen Polymere arbeiten. Außerdem ist die Atomkraftmikroskopie (AFM) für die Untersuchungen synthetischer Polymermoleküle geeignet. AFM bietet eine einzigartige Möglichkeit einer 3D -Visualisierung von Polymerketten. Beispielsweise ist der AFM-Tippmodus sanft genug für die Aufzeichnung von adsorbierten Polyelektrolytmolekülen (z. B. 0,4 nm dicke Ketten von Poly (2-Vinylpyridin)) unter flüssigem Medium. Die Position der Zweiketten-Superposition entspricht in diesen Experimenten der doppelten Dicke der Einzelkette (0,8 nm im Fall des genannten Beispiels). Bei der Anwendung der ordnungsgemäßen Scanparameter bleibt die Konformation solcher Moleküle stundenlang unverändert, was die Leistung von Experimenten unter flüssigen Medien mit verschiedenen Eigenschaften ermöglicht.[1] Darüber hinaus können durch Steuerung der Kraft zwischen der Spitze und den hochauflösenden Probenbildern erhalten werden.[5][6] Optische Pinzetten wurden auch verwendet, um DNA-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen und zu quantifizieren.[5][6]

Über die Experimente

Konzept

Die Einzelmolekül-Fluoreszenzspektroskopie verwendet die Fluoreszenz eines Moleküls, um Informationen über seine Umgebung, Struktur und Position zu erhalten. Die Technik ermöglicht die Fähigkeit, Informationen zu erhalten, die ansonsten aufgrund der Mittelung des Ensemble nicht verfügbar sind (dh ein Signal, das bei der gleichzeitigen Aufzeichnung vieler Moleküle erhalten wird, stellt eine durchschnittliche Eigenschaft der Dynamik der Moleküle dar). Die Ergebnisse in vielen Experimenten einzelner Moleküle sind Zwei-Staaten-Flugbahnen.

Einkanalaufzeichnung

Siehe auch: Patch -Klemme
Zwei Beispiele für Daten (jeweils ~ 10 s) aus einem Einzelkanalaufzeichnungsexperiment unter Verwendung der Patch-Clamp-Technik. Die obere Spur befindet sich in einer niedrigeren Konzentration, während die untere Spur in einer Agonistenkonzentration in der Nähe dieses Ionenkanals EC aufgezeichnet wird50. Kanalöffnungen werden durch Abwärtsablenkungen dargestellt, in diesem Fall Ablenkungen von ungefähr 5 PA.

Wie im Fall einer Einzelmolekül-Fluoreszenzspektroskopie kann die als Einzelkanalaufzeichnung bekannte Technik verwendet werden durchgeführt.[7] Insbesondere wechseln sich Ionenkanäle zwischen leitenden und nicht leitenden Klassen, die sich in der Konformation unterscheiden. Daher kann der Funktionszustand von Ionenkanälen direkt mit ausreichend empfindlicher Elektronik gemessen werden, sofern ordnungsgemäße Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um den Rauschen zu minimieren. Jedes dieser Klassen kann wiederum in einen oder mehrere kinetische Zustände unterteilt werden, wobei der direkte Einfluss auf die zugrunde liegende Funktion des Ionenkanals ist. Durch die Durchführung dieser Arten von Einzelmolekülstudien unter systematisch variierenden Bedingungen (z. B. Agonistenkonzentration und -struktur, Permeantion und/oder Kanalblocker, Mutationen im Ionenkanal -Aminosäuren) können Informationen über die Interkonversion verschiedener kinetischer Zustände des Ionenkanals liefern. In einem minimalen Modell für einen Ionenkanal gibt es zwei Staaten: offen und geschlossen. Es werden jedoch häufig andere Zustände benötigt, um die Daten genau darzustellen, einschließlich mehrerer geschlossener Zustände sowie inaktiven und/oder desensibilisierten Zustände, bei denen es sich nicht um leitende Zustände handelt, die auch bei Vorhandensein von Stimulus auftreten können.[7]

Biomolekülmarkierung

Single Fluorophore Kann chemisch an Biomolekülen wie Proteinen oder DNA gebunden werden, und die Dynamik einzelner Moleküle kann durch Überwachung der Fluoreszenzsonde verfolgt werden. Räumliche Bewegungen innerhalb der Rayleigh Limit Kann zusammen mit Änderungen der Emissionsintensität und/oder der Strahlungslebensdauer verfolgt werden, die häufig Veränderungen in der lokalen Umgebung anzeigen. Zum Beispiel hat die Kennzeichnung der Einzelmolekül eine große Menge an Informationen darüber geliefert, wie Kinesin Motorproteine ​​bewegen sich weiter Mikrotubuli Stränge in Muskelzellen. Die Einzelmoleküle-Bildgebung in lebenden Zellen zeigt interessante Informationen über die Proteindynamik unter seiner physiologischen Umgebung. Mehrere biophysikalische Parameter über die Proteindynamik können quantifiziert werden, wie z. B. Diffusionskoeffizienten, mittlere quadratische Verschiebungen, Verweilzeit, der Anteil gebundener und ungebundener Moleküle und Zielsuchmechanismus der Proteinbindung an seine Zielstelle in der Live-Zelle.[8]

Einmolekül Fluoreszenzresonanzenergieübertragung (Bund)

Hauptartikel smfret.

In Einzelmolekül FluoreszenzresonanzenergieübertragungDas Molekül ist an (mindestens) zwei Stellen markiert. Ein Laserstrahl konzentriert sich auf das Molekül, das die erste Sonde spreizt. Wenn sich diese Sonde entspannt und ein Photon ausgibt, hat sie die Chance, die andere Sonde zu spenden. Die Effizienz der Absorption des Photons, die aus der ersten Sonde in der zweiten Sonde emittiert werden, hängt vom Abstand zwischen diesen Sonden ab. Da sich die Entfernung mit der Zeit ändert, untersucht dieses Versuch die interne Dynamik des Moleküls.

Einzelmolekül-Experimente gegen Ensemble-Experimente

Bei der Betrachtung von Daten im Zusammenhang mit einzelnen Molekülen kann man normalerweise Propagatoren konstruieren und Zeitwahrscheinlichkeitsdichtefunktionen der ersten Ordnung, der zweiten Ordnung usw., während man aus Bulk -Experimenten normalerweise den Zerfall einer Korrelationsfunktion erhält.[9] Aus den Informationen, die in diesen einzigartigen Funktionen (aus einzelnen Molekülen erhalten) enthalten sind, kann man ein relativ klares Bild auf die Art und Weise extrahieren, wie sich das System verhält. z.B. es ist Kinetisches Schema,[10] oder sein Aktivitätspotential oder seines Reduzierte Abmessungen.[11][12] Insbesondere kann man (viele Eigenschaften von) den Reaktionsweg eines Enzyms konstruieren, wenn man die Aktivität eines einzelnen Enzyms überwacht.[13] Darüber hinaus wurden von mehreren Autoren beschrieben[7] Andererseits gibt es mehrere Probleme mit der Analyse von Einzelmoleküldaten, einschließlich der Konstruktion einer Umgebung mit niedrigem Rauschen und isolierten Pipet -Spitzen, Filtern einiger der verbleibenden unerwünschten Komponenten (Rauschen) in Aufzeichnungen und der für Daten erforderlichen Zeitdauer Analyse (Vorverarbeitung, eindeutige Erkennung von Ereignissen, Datenaufzeichnung, Anpassung kinetischer Schemata usw.).

Einfluss

Einzelmolekül-Techniken beeinflussten Optik, Elektronik, Biologie und Chemie. In den biologischen Wissenschaften beschränkte sich die Untersuchung von Proteinen und anderen komplexen biologischen Maschinen auf Ensemble -Experimente, die die direkte Beobachtung ihrer Kinetik nahezu unmöglich machten. Zum Beispiel wurde es erst nach der Untersuchung von Kinesin-Myosin-Paaren im Muskelgewebe verstanden, nachdem die Fluoreszenzmikroskopie mit einer einzelnen Molekül-Mikroskopie verstanden wurde. Diese Experimente waren jedoch größtenteils auf In -vitro -Studien beschränkt, da nützliche Techniken für die Bildgebung der lebenden Zellen noch nicht vollständig realisiert werden müssen. Das Versprechen von Einzelmolekül in vivo Bildgebung,[14] bringt jedoch ein enormes Potenzial mit sich, um Bio-Moleküle in nativen Prozessen direkt zu beobachten. Diese Techniken zielen häufig für Studien an, an denen Proteine ​​mit niedriger Kopie beteiligt sind, von denen viele noch entdeckt werden. Diese Techniken wurden auch auf Untersuchungsbereiche der Chemie ausgeweitet, einschließlich der Kartierung heterogener Oberflächen.[15]

Siehe auch

Verweise

  1. ^ a b Roiter V, Minko S (2005). "AFM-Einzelmolekül-Experimente an der Feststoff-Flüssig-Grenzfläche: In-situ-Konformation von adsorbierten flexiblen Polyelektrolytketten". Zeitschrift der American Chemical Society. 127 (45): 15688–15689. doi:10.1021/ja0558239.
  2. ^ Juette MF, Terry DS, Wasserman MR, Zhou Z, Altman RB, Zheng Q, Blanchard SC (Juni 2014). "Die glänzende Zukunft der Einmolekül Fluoreszenzbildgebung". Curr Opin Chem Biol. 20: 103–111. doi:10.1016/j.cbpa.2014.05.010. PMC 4123530. PMID 24956235.
  3. ^ W. E. Moerner und L. Kador, Optischer Nachweis und Spektroskopie einzelner Moleküle in einem Feststoff, Phys. Rev. Lett. 62, 2535 - 2538 (1989)
  4. ^ M. Orrit und J. Bernard, Einzelpentacenmoleküle, die durch Fluoreszenzanregung in a nachgewiesen wurden p-Terphenylkristall, Phys. Rev. Lett. 65, 2716–2719 (1990)
  5. ^ a b Murugesapillai D, et al. (2014). "Die DNA-Überbrückung und -aufschlüsselung durch HMO1 liefert einen Mechanismus zum Stabilisierenden von Nucleosomenfreies Chromatin". Nukleinsäuren Res. 42 (14): 8996–9004. doi:10.1093/nar/gku635.
  6. ^ a b Murugesapillai D, et al. (2016). "Einzelmolekülstudien zu architektonischen DNA-Biegeproteinen der Architektur-Architektur der Gruppe B". Biophys rev. 9 (1): 17–40. doi:10.1007/s12551-016-0236-4. PMC 5331113. PMID 28303166.
  7. ^ a b c B. Sakmann und E. Neher,, Einkanalaufzeichnung, ISBN9780306414190 (1995).
  8. ^ Podh, Nitesh Kumar; Paliwal, Sheetal; Dey, Partha; Das, Ayan; Morjaria, Shruti; Mehta, Gunjan (5. November 2021). "In-vivo-Single-Molekül-Bildgebung in Hefe: Anwendungen und Herausforderungen". Journal of Molecular Biology. 433 (22): 167250. doi:10.1016/j.jmb.2021.167250.
  9. ^ O. Flomenbom, J. Klafter und A. Szabo, Was kann man von zweistaatlichen Einzelmolekül-Trajektorien lernen? Archiviert 14. Januar 2012 bei der Wayback -Maschine, Biophys. J. 88, 3780–3783 (2005); Arxiv:q-bio/0502006
  10. ^ Srinivasan, Bharath (2020-10-08). "Explizite Behandlung von Nicht-Michaelis-Menten- und atypischen Kinetik in der frühen Wirkstoffentdeckung". dx.doi.org. Abgerufen 2020-11-09.
  11. ^ O. Flomenbom und R. J. Silbey, Verwendung der Informationsinhalte in zweistaatlichen Flugbahnen Archiviert 14. Januar 2012 bei der Wayback -Maschine, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 10907–10910 (2006).
  12. ^ O. Flomenbom und R. J. Silbey, Toolbox zur Analyse endlicher Zwei-Staaten-Trajektorien, Phys. Rev. E 78, 066105 (2008); ARXIV: 0802.1520.
  13. ^ O. Flomenbom, K. Velonia, D. Loos et al.,, Gestreckter exponentieller Zerfall und Korrelationen in der katalytischen Aktivität schwankender Einzellipase -Moleküle Archiviert 14. Januar 2012 bei der Wayback -Maschine, Proc. Natl. Acad. Sci. US 102, 2368–2372 (2005).
  14. ^ Zhan, Hong; Stanciauskas, Ramunas; Stigloher, Christus; Dizon, Kevin K.; Jospin, Maelle; Besserau, Jean-Louis; Pinaud, Fabien (2014). "In vivo Single-Molekül-Bildgebung identifiziert veränderte Dynamik von Calciumkanälen in Dystrophin-Mutanten C. elegans". Naturkommunikation. 5: ncomms5974. Bibcode:2014natco ... 5.4974z. doi:10.1038/ncomms5974. PMC 4199201. PMID 25232639.
  15. ^ Walder, R.; Nelson, N.; Schwartz, D. K. (2011). "Superauflösende Oberflächenkartierung unter Verwendung der Trajektorien von molekularen Sonden". Naturkommunikation. 2: 515. Bibcode:2011natco ... 2..515W. doi:10.1038/ncomms1530. PMID 22044994.