Optisches Mikroskop

Wissenschaftler verwenden optische Mikroskope, um das Wachstum zu untersuchen Zellen

Das Optisches Mikroskop, auch als als bezeichnet Lichtmikroskop, ist eine Art von Mikroskop Das verwendet gewöhnlich sichtbares Licht und ein System von Linsen So erzeugen Sie vergrößerte Bilder kleiner Objekte. Optische Mikroskope sind das älteste Design von Mikroskop und wurden möglicherweise in ihrer gegenwärtigen zusammengesetzten Form im 17. Jahrhundert erfunden. Grundlegende optische Mikroskope können sehr einfach sein, obwohl sich viele komplexe Designs verbessern wollen Auflösung und Probe Kontrast.

Das Objekt wird auf a platziert Bühne und kann direkt durch ein oder zwei betrachtet werden Augenmerkmale auf dem Mikroskop. In Hochleistungsmikroskopen zeigen beide Augenmärkte typischerweise dasselbe Bild, jedoch mit a Stereo -MikroskopEs werden leicht unterschiedliche Bilder verwendet, um einen 3-D-Effekt zu erzeugen. Eine Kamera wird normalerweise zum Erfassen des Bildes verwendet (Aufnahme).

Die Probe kann auf verschiedene Arten beleuchtet werden. Transparente Objekte können von unten beleuchtet werden und feste Objekte können mit Licht beleuchtet werden (durchkommt (Helles Feld) oder um (dunkles Feld) Die objektive Linse. Polarisiertes Licht kann verwendet werden, um die Kristallorientierung von metallischen Objekten zu bestimmen. Phasenkontrastbildgebung Kann verwendet werden, um den Bildkontrast zu erhöhen, indem kleine Details des unterschiedlichen Brechungsindex hervorgehoben werden.

Ein Bereich von Zielsetzung Objektive mit unterschiedlicher Vergrößerung werden normalerweise auf einem Turm angebracht, sodass sie eingerichtet werden können und die Fähigkeit zum Zoomen ermöglichen. Die maximale Vergrößerungsleistung von optischen Mikroskopen ist aufgrund der begrenzten Auflösungsleistung von sichtbarem Licht typischerweise auf rund 1000x begrenzt. Während größere Vergrößerungen möglich sind, werden keine zusätzlichen Details des Objekts gelöst.

Alternativen zur optischen Mikroskopie, die kein sichtbares Licht verwenden Rasterelektronenmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie und Scan -Sonde -Mikroskopie und kann als Ergebnis viel größere Vergrößerungen erzielen.

Typen

Diagramm eines einfachen Mikroskops

Es gibt zwei grundlegende Arten von optischen Mikroskopen: einfache Mikroskope und Verbindungsmikroskope. Ein einfaches Mikroskop verwendet das optische Kraft von Einzellinsen oder einer Gruppe von Linsen zur Vergrößerung. Ein Verbindungsmikroskop verwendet ein Linsensystem (ein Satz vergrößert das von einem andere erzeugte Bild), um eine viel höhere Vergrößerung eines Objekts zu erreichen. Die überwiegende Mehrheit der modernen Forschung Mikroskope sind zusammengesetzte Mikroskope, während einige billiger kommerziell sind Digitale Mikroskope sind einfache Einzellinsenmikroskope. Verbundmikroskope können weiter in eine Vielzahl anderer Arten von Mikroskopen unterteilt werden, die sich in ihren optischen Konfigurationen, Kosten und beabsichtigten Zwecken unterscheiden.

Einfaches Mikroskop

Ein einfaches Mikroskop verwendet ein Objektiv oder eine Reihe von Linsen, um ein Objekt allein durch Winkelvergrößerung zu vergrößern, was dem Betrachter einen aufrechten Vergrößerung verleiht virtuelles Bild.^[1][2] Die Verwendung eines einzelnen konvexen Objektivs oder einer Linsengruppe findet sich in einfachen Vergrößerungsgeräten wie dem Lupe, Lupen, und Augenmerkmale Für Teleskope und Mikroskope.

Verbindungsmikroskop

Diagramm eines Verbindungsmikroskops

Ein Verbindungsmikroskop verwendet ein Objektiv in der Nähe des Objekts, um Licht zu sammeln (genannt Zielsetzung Linse), die sich konzentriert a Echtes Bild des Objekts im Mikroskop (Bild 1). Dieses Bild wird dann durch eine zweite Linse oder eine Gruppe von Linsen vergrößert (genannt Okular) Das gibt dem Betrachter ein vergrößertes invertiertes virtuelles Bild des Objekts (Bild 2).^[3] Die Verwendung einer zusammengesetzten Kombination aus objektivem/Augenhaut ermöglicht eine viel höhere Vergrößerung. Gemeinsame zusammengesetzte Mikroskope verfügen häufig über austauschbare Objektivlinsen, sodass der Benutzer die Vergrößerung schnell einstellen kann.^[3] Ein Verbindungsmikroskop ermöglicht auch fortgeschrittenere Beleuchtungsaufbauten, wie z. Phasenkontrast.

Andere Mikroskopvarianten

Für spezielle Zwecke gibt es viele Varianten des Verbund optischen Mikroskopdesigns. Einige davon sind physikalische Designunterschiede, die für bestimmte Zwecke Spezialisierung ermöglichen:

• Stereo -Mikroskop, ein geringes Mikroskop, das eine stereoskopische Ansicht der Probe bietet, die üblicherweise für die Dissektion verwendet wird.
• Vergleichsmikroskop, mit zwei separaten Lichtpfaden, die einen direkten Vergleich von zwei Proben über ein Bild in jedem Auge ermöglichen.
• Umgekehrter Mikroskopzum Untersuchung von Proben von unten; Nützlich für Zellkulturen in Flüssigkeit oder für Metallographie.
• Faseranschluss-Inspektionsmikroskop, das für die End-Face-Inspektion der Stecker ausgelegt ist
• Reisemikroskopzum Untersuchung von Proben von Hoch optische Auflösung.

Andere Mikroskopvarianten sind für verschiedene Beleuchtungstechniken ausgelegt:

• Petrographisches Mikroskop, dessen Design normalerweise einen polarisierenden Filter, eine rotierende Stufe und eine Gipsplatte umfasst, um die Untersuchung von Mineralien oder anderen kristallinen Materialien zu erleichtern, deren optische Eigenschaften mit der Orientierung variieren können.
• Polarisationsmikroskopähnlich wie das petrographische Mikroskop.
• Phasenkontrastmikroskop, was die Phasenkontrastbeleuchtungsmethode anwendet.
• Epifluoreszenzmikroskopfür die Analyse von Proben, die Fluorophore umfassen.
• Konfokales Mikroskop, Eine weit verbreitete Variante der Epifluoreszenzbeleuchtung, bei der ein Scanlaser verwendet wird, um eine Probe für die Fluoreszenz zu beleuchten.
• Zwei-Photonen-Mikroskop, verwendet, um Fluoreszenz tiefer in Streumedien zu stellen und das Fotobleaching zu reduzieren, insbesondere in lebenden Proben.
• Schülermikroskop-Ein oft geringes Mikroskop mit geringem Stromverbrauch mit vereinfachten Kontrollen und manchmal von geringer Qualität für die Schulnutzung oder als Starterinstrument für Kinder.^[4]
• Ultramikroskop, ein angepasstes Lichtmikroskop, das verwendet Lichtstreuung um winzige Partikel zu sehen, deren Durchmesser unter oder in der Nähe der Wellenlänge des sichtbaren Lichts liegt (etwa 500 Nanometer); Meistens veraltet seit dem Aufkommen von Elektronenmikroskope
• Tippverbesserte Raman-Mikroskopist eine Variante des optischen Mikroskops basierend auf Tippverbesserte Raman-Spektroskopie, ohne traditionelle Wellenlängenbasis-Auflösungsgrenzen.^[5][6] Dieses Mikroskop wurde hauptsächlich auf dem realisiert Rasterproben-Mikroskop Plattformen mit allen optischen Tools.

Digital microscope

Eine Miniatur USB -Mikroskop.

A Digitales Mikroskop ist ein Mikroskop, das mit a ausgestattet ist Digitalkamera Beobachtung einer Probe über a Computer. Mikroskope können auch teilweise oder vollständig computergesteuert sein und verschiedene Automatisierungsstufen haben. Die digitale Mikroskopie ermöglicht eine höhere Analyse eines Mikroskopbildes, beispielsweise Messungen von Entfernungen und Bereichen und Quantifizierung eines Fluoreszenzes oder histologisch Fleck.

Digitale Mikroskope mit geringem Stromverbrauch,, USB -Mikroskopesind auch im Handel erhältlich. Diese sind im Wesentlichen Webcams mit einem leistungsstarken Makro-Objektiv und benutze im Allgemeinen nicht Transillumination. Die Kamera direkt an die angeschlossen USB Port eines Computers, damit die Bilder direkt auf dem Monitor angezeigt werden. Sie bieten bescheidene Vergrößerungen (bis zu etwa 200 ×), ohne dass Augenmännchen verwendet werden müssen, und zu sehr günstigen Kosten. Hochleistungsbeleuchtung wird normalerweise von einem bereitgestellt LED Quelle oder Quellen neben dem Kameraobjektiv.

Digitale Mikroskopie mit sehr geringem Licht, um eine Beschädigung schutzbedürftiger biologischer Proben zu vermeiden, ist unter Verwendung empfindlicher Photonenzahlung Digitalkameras. Es wurde gezeigt, dass eine Lichtquelle, die Paare von Paaren liefert verwickelte Photonen kann das Risiko einer Schädigung der am stärksten sensiblen Proben minimieren. In dieser Anwendung von Geisterbildgebung Zur Photonsparse-Mikroskopie wird die Probe mit Infrarot-Photonen beleuchtet, von denen jeweils räumlich mit einem verstrichenen Partner im sichtbaren Band korreliert wird, um durch eine Photonenzahlkamera eine effiziente Bildgebung zu erzielen.^[7]

Geschichte

Erfindung

Die frühesten Mikroskope waren Single Linse Vergrößerungsgläser mit begrenzter Vergrößerung, die mindestens bis zur weit verbreiteten Verwendung von Objektiven in datieren Brille Im 13. Jahrhundert.^[8]

Verbindungsmikroskope erschienen erstmals um 1620 in Europa^[9][10] einschließlich eines, das demonstriert wurde durch Cornelis Drebbel in London (um 1621) und einer in Rom 1624 ausgestellt.^[11][12]

Der tatsächliche Erfinder des Verbindungsmikroskops ist unbekannt, obwohl im Laufe der Jahre viele Behauptungen erhoben wurden. Dazu gehören eine Behauptung 35^[13] Jahre nachdem sie erschienen sind Niederländisch Spektakelmacher Johannes Zachariassen, dass sein Vater, Zacharias Janssen, erfand das zusammengesetzte Mikroskop und/oder das Teleskop bereits 1590. Johannes (einige behaupten zweifelhaft)^[14][15][16] Das Zeugnis drängt das Erfindungsdatum bisher zurück, dass Zacharias zu diesem Zeitpunkt ein Kind gewesen wäre, was zu Spekulationen geführt hätte, dass das zusammengesetzte Mikroskop für Johannes 'Behauptung, dass er wahr ist, von Johannes' Großvater Hans Martens erfunden werden müsste.^[17] Eine weitere Behauptung ist, dass Janssens Konkurrent, Hans Lippershey (WHO WHORETEN DAS ERSTE TELESCOPE -PATENT 1608) erfand auch das zusammengesetzte Mikroskop.^[18] Andere Historiker verweisen mit seinem 1621 -Verbindungsmikroskop auf den niederländischen Innovator Cornelis Drebbel.^[11][12]

Galileo Galilei wird manchmal auch als zusammengesetzter Mikroskop -Erfinder zitiert. Nach 1610 stellte er fest, dass er sein Teleskop fokussieren konnte, um kleine Objekte wie Fliegen zu sehen, Nahaufnahme^[19] und/oder könnte das falsche Ende in umgekehrt schauen, um kleine Objekte zu vergrößern.^[20] Der einzige Nachteil war, dass sein 2 Fuß langes Teleskop auf 6 Fuß ausgedehnt werden musste, um Objekte zu sehen, die sich schließen.^[21] Nachdem Galileo das von Drebbel in Rom ausstellende zusammengesetzte Mikroskop von Drebbel gesehen hatte, baute er seine eigene verbesserte Version.^[11][12] 1625, Giovanni Faber geprägt den Namen Mikroskop Für das zusammengesetzte Mikroskop Galileo, das dem übermittelt wurde Accademia dei Lincei 1624 ^[22] (Galileo hatte es die "genannt" genannt "Occhiolino" oder "kleines Auge"). Faber prägte den Namen aus dem griechisch Wörter μικρärm (Mikron) bedeutet "klein" und σκοπεῖν (Skopein) bedeutet "Anschauen", ein Name, der mit analogem "mithalten soll"Teleskop", ein anderes Wort, das von den Linsen geprägt wurde.^[23]

Christiaan Huygens, ein weiterer Niederländer, entwickelte im späten 17. Jahrhundert ein einfaches 2-Linsen-Augensystem, das war achromatisch korrigiert und daher ein großer Schritt nach vorne in der Mikroskopentwicklung. Das Huygens -Auge wird bis heute produziert, leidet jedoch unter einer kleinen Feldgröße und anderen geringfügigen Nachteilen.

Popularisierung

Das älteste veröffentlichte Bild, von dem bekannt ist, dass er mit einem Mikroskop gemacht wurde: Bienen von Francesco Stelluti, 1630^[24]

Antonie van Leeuwenhoek (1632–1724) wird zugeschrieben, das Mikroskop von Biologen aufmerksam zu machen, obwohl im 16. Jahrhundert bereits einfache Vergrößerungslinsen hergestellt wurden. Van Leeuwenhoeks hausgemachte Mikroskope waren einfache Mikroskope mit einer einzigen sehr kleinen, aber starken Linse. Sie waren unangenehm in Gebrauch, ermöglichten Van Leeuwenhoek jedoch detaillierte Bilder. Es dauerte ungefähr 150 Jahre optische Entwicklung, bis das zusammengesetzte Mikroskop aufgrund der Schwierigkeiten bei der Konfiguration mehrerer Linsen das gleiche Qualitätsbild wie Van Leeuwenhoeks einfache Mikroskope liefern konnte. In den 1850er Jahren, John Leonard RiddellProfessor für Chemie bei Tulane Universityerfand das erste praktische Fernglasmikroskop, während er eine der frühesten und umfangreichsten amerikanischen mikroskopischen Untersuchungen durchführte Cholera.^[25][26]

Beleuchtungstechniken

Während die grundlegende Mikroskoptechnologie und Optik seit über 400 Jahren verfügbar sind, wurden in jüngerer Zeit Techniken bei der Probenbeleuchtung entwickelt, um die heutigen hochwertigen Bilder zu erzeugen.

Im August 1893, August Köhler aufgetreten Köhler -Beleuchtung. Diese Methode der Stichprobenbeleuchtung führt zu extrem gleichmäßiger Beleuchtung und überwindet viele Einschränkungen älterer Techniken der Probenbeleuchtung. Vor der Entwicklung der Köhler -Beleuchtung das Bild der Lichtquelle, zum Beispiel a die Glühbirne Filament war im Bild der Probe immer sichtbar.

Das Nobelpreis in der Physik wurde an den niederländischen Physiker vergeben Frits Zernike 1953 für seine Entwicklung von Phasenkontrast Beleuchtung, die die Bildgebung transparenter Proben ermöglicht. Durch die Nutzung Interferenz statt Absorption von leichten, extrem transparenten Proben wie Live Säugetier- Zellen können abgebildet werden, ohne Färbungstechniken anzuwenden. Nur zwei Jahre später, 1955,, Georges Nomarski veröffentlichte die Theorie für Differentieller Interferenzkontrast Mikroskopie, ein anderer Interferenz-basierte Bildgebungstechnik.

Fluoreszenzmikroskopie

Die moderne biologische Mikroskopie hängt stark von der Entwicklung von ab fluoreszierend Sonden für bestimmte Strukturen innerhalb einer Zelle. Im Gegensatz zu normaler transilluminierter Lichtmikroskopie in Fluoreszenzmikroskopie Die Probe wird durch die objektive Linse mit einem schmalen Satz von Lichtwellenlängen beleuchtet. Dieses Licht interagiert mit Fluorophoren in der Probe, die dann das Licht eines längeren Zeitraums emittieren Wellenlänge. Es ist dieses emittierte Licht, das das Bild ausmacht.

Seit der Mitte des 20. Jahrhunderts chemische Fluoreszenzflecken wie z. DAPI das bindet an DNA, wurden verwendet, um bestimmte Strukturen innerhalb der Zelle zu kennzeichnen. Zu den neueren Entwicklungen gehören Immunfluoreszenz, was fluoreszenzmarkiert wird Antikörper spezifische Proteine ​​innerhalb einer Probe zu erkennen, und fluoreszierende Proteine ​​wie GFP was eine lebende Zelle kann ausdrücken es fluoreszierend macht.

Komponenten

Grundlegende optische Transmissionsmikroskopelemente (1990er Jahre)

Alle modernen optischen Mikroskope, die zum Betrachten von Proben durch übertragenes Licht ausgelegt sind, teilen die gleichen grundlegenden Komponenten des Lichtwegs. Darüber hinaus hat die überwiegende Mehrheit der Mikroskope die gleichen "strukturellen" Komponenten^[27] (unten nach dem Bild rechts nummeriert):

• Okular (Augenlinse) (1)
• Objektives Turm, Revolver oder revolvierendes Nasenstück (um mehrere objektive Objektive zu halten) (2)
• Objektivlinsen (3)
• Fokusknöpfe (um die Bühne zu bewegen)
  • Grobe Einstellung (4)
  • Feinanpassung (5)
• Stufe (um das Probe zu halten) (6)
• Lichtquelle (a hell oder ein Spiegel) (7)
• Zwerchfell und Kondensator (8)
• Mechanische Stufe (9)

Okular (Augenlinse)

Das Okularoder Augenlinse ist ein Zylinder mit zwei oder mehr Objektiven; Seine Funktion besteht darin, das Bild für das Auge in den Fokus zu bringen. Das Okular wird in das obere Ende des Körperrohrs eingeführt. Augenmerkmale sind austauschbar und viele verschiedene Augenmerkmale können mit unterschiedlichen Vergrößerungsgraden eingeführt werden. Die typischen Vergrößerungswerte für Okulare sind 5 ×, 10 × (die häufigsten), 15 × und 20 ×. In einigen Hochleistungsmikroskopen wird die optische Konfiguration der objektiven Objektiv und des Okulares übereinstimmt, um die bestmögliche optische Leistung zu erzielen. Dies tritt am häufigsten bei apochromatisch Ziele.

Objektives Turm (Revolver oder Drehung Nasenstück)

Objektives Turm, Revolver oder revolvierendes Nasenstück ist der Teil, der die Reihe von Objektivlinsen enthält. Es ermöglicht dem Benutzer, zwischen objektiven Objektiven zu wechseln.

Objektivlinse

Am unteren Ende eines typischen Verbindungs ​​optischen Mikroskops gibt es einen oder mehrere Objektivlinsen Das sammelt Licht aus der Probe. Das Ziel ist normalerweise in einem Zylindergehäuse, das eine Glas- oder Mehrfachverbindungslinse enthält. In der Regel werden drei objektive Objektive in ein kreisförmiges Nasenstück eingeschraubt, das möglicherweise gedreht werden kann, um die erforderliche objektive Linse auszuwählen. Diese Arrangements sollen sein Parfokal, was bedeutet, dass die Probe, wenn man von einem Objektiv zum anderen auf einem Mikroskop wechselt, in der Probe bleibt Fokus. Mikroskopziele sind durch zwei Parameter gekennzeichnet, nämlich, nämlich, Vergrößerung und Numerische Blende. Ersteres reicht typischerweise von 5 × bis 100 ×, während der letztere zwischen 0,14 und 0,7 liegt, was entspricht Brennweiten von etwa 40 bis 2 mm. Objektivlinsen mit höheren Vergrößerungen haben normalerweise eine höhere numerische Apertur und eine kürzere Tiefenschärfe im resultierenden Bild. Einige Hochleistungsobjektivobjektive erfordern möglicherweise übereinstimmende Okular, um die beste optische Leistung zu erzielen.

Öleintauchungsziel

Zwei Leica Öleintauchen Mikroskop -Objektivlinsen: 100 × (links) und 40 × (rechts)

Einige Mikroskope verwenden von Öl-immersionsziele oder Wasser immersionsziele für eine stärkere Auflösung bei hoher Vergrößerung. Diese werden mit verwendet Index-Matching-Material wie zum Beispiel Eintauchöl oder Wasser und eine übereinstimmende Abdeckung zwischen der Objektivlinse und der Probe. Der Brechungsindex des Indexanpassungsmaterials ist höher als die Luft, wodurch die objektive Linse eine größere numerische Apertur (mehr als 1) aufweist, so dass das Licht mit minimaler Brechung vom Probe auf die äußere Gesichtsfläche der objektiven Linse übertragen wird. Numerische Aperturen von bis zu 1,6 können erreicht werden.^[28] Die größere numerische Apertur ermöglicht die Sammlung von leichten, detaillierten Beobachtungen kleinerer Details möglich. Eine Öleintauchobjektiv hat normalerweise eine Vergrößerung von 40 bis 100 ×.

Fokusknöpfe

Einstellknöpfe bewegen die Bühne mit separater Einstellung für grobe und feine Fokussierung nach oben und unten. Die gleichen Steuerelemente ermöglichen es dem Mikroskop, sich an Proben unterschiedlicher Dicke einzustellen. Bei älteren Konstruktionen von Mikroskopen bewegen die Fokusanpassungsräder das Mikroskoprohr relativ zum Stand nach oben oder unten und hatten eine feste Stufe.

Rahmen

Die gesamte optische Baugruppe ist traditionell an einem starren Arm gebunden, was wiederum an einem robusten U-förmigen Fuß befestigt ist, um die erforderliche Starrheit zu gewährleisten. Der Armwinkel kann einstellbar sein, damit der Betrachtungswinkel eingestellt werden kann.

Der Rahmen bietet einen Montagepunkt für verschiedene Mikroskopsteuerungen. Normalerweise umfasst dies Steuerelemente für die Fokussierung, typischerweise ein großes Rollelrad, um grobkara Fokus zusammen mit einem kleineren Rollelrad anzupassen, um den feinen Fokus zu kontrollieren. Andere Merkmale können Lampensteuerungen und/oder Steuerelemente zur Einstellung des Kondensators sein.

Bühne

Die Bühne ist eine Plattform unterhalb der objektiven Linse, die das zu sehene Exemplar unterstützt. In der Mitte der Bühne befindet sich ein Loch, durch das Licht verläuft, um das Exemplar zu beleuchten. Die Bühne hat normalerweise Arme zu halten Folien (Rechteckige Glasplatten mit typischen Abmessungen von 25 × 75 mm, auf denen die Probe montiert ist).

Bei Vergrößerungen ist es nicht praktisch, dass ein Rutsch von Hand ist. Eine mechanische Stufe, die für Mikroskope mit mittlerer und höherer Preisträger typisch ist, ermöglicht winzige Bewegungen des Objektträgers über Kontrollknöpfe, die die Probe/den Schlitten nach Wunsch neu positionieren. Wenn ein Mikroskop ursprünglich keine mechanische Stufe hatte, kann es möglich sein, eines hinzuzufügen.

Alle Phasen bewegen sich für den Fokus auf und ab. Mit einer mechanischen Stufe bewegen sich Objektträger auf zwei horizontalen Achsen, um die Probe zu positionieren, um die Probendetails zu untersuchen.

Die Fokussierung beginnt mit niedrigerer Vergrößerung, um die Probe durch den Benutzer auf der Bühne zu zentrieren. Um eine höhere Vergrößerung zu bewegen, muss die Stufe bei der höheren Vergrößerung vertikal höher bewegt werden, und es kann auch eine leichte horizontale Positionseinstellung erfordern. Horizontale Probenpositionsanpassungen sind der Grund für eine mechanische Stufe.

Aufgrund der Schwierigkeit, Exemplare vorzubereiten und auf Folien zu montieren, ist es für Kinder am besten, mit vorbereiteten Folien zu beginnen, die zentriert sind und sich leicht konzentrieren, unabhängig von der verwendeten Fokusebene.

Lichtquelle

Viele Lichtquellen können verwendet werden. Am einfachsten wird Tageslicht über a geleitet Spiegel. Die meisten Mikroskope haben jedoch ihre eigene einstellbare und steuerbare Lichtquelle - oft a Halogenlampe, obwohl Beleuchtung verwendet LEDs und Laser werden zu einer häufigeren Versorgung. Köhler -Beleuchtung wird oft auf teureren Instrumenten bereitgestellt.

Kondensator

Das Kondensator ist ein Objektiv, das Licht aus der Beleuchtungsquelle auf die Probe fokussiert. Der Kondensator kann auch andere Funktionen enthalten, wie z. Membran und/oder filtern, um die Qualität und Intensität der Beleuchtung zu verwalten. Für Beleuchtungstechniken wie dunkles Feld, Phasenkontrast und Differentieller Interferenzkontrast Mikroskopie Zusätzliche optische Komponenten müssen genau im Lichtweg ausgerichtet sein.

Vergrößerung

Die tatsächliche Kraft oder Vergrößerung eines zusammengesetzten optischen Mikroskops ist das Produkt der Kräfte der Okular und die objektive Linse. Beispielsweise ergibt eine 10 -fach -Augenhautvergrößerung und eine 100 -fache objektive Linsenvergrößerung eine Gesamtvergrößerung von 1.000 ×. Modifizierte Umgebungen wie die Verwendung von Öl oder ultraviolettem Licht können die Auflösung erhöhen und aufgelöste Details bei Vergrößerungen von mehr als 1.000 x ermöglichen.

Betrieb

UNS. CBP Office of Field Operations Agent überprüft die Authentizität von a Reisedokument eine Lohe Internationaler Flughafen Verwendung einer Stereo -Mikroskop

Beleuchtungstechniken

Es stehen viele Techniken zur Verfügung, die den Lichtweg modifizieren, um eine verbesserte Erzeugung zu erzeugen Kontrast Bild aus einer Probe. Haupttechniken zur Erzeugung eines erhöhten Kontrasts aus der Probe umfassen Kreuzpolarisiertes Licht, dunkles Feld, Phasenkontrast und Differentieller Interferenzkontrast Erleuchtung. Eine aktuelle Technik (Sarfus) kombiniert Kreuzpolarisiertes Licht und spezifische kontrastverstärkte Objektträger für die Visualisierung nanometrischer Proben.

• Vier Beispiele für Transsiluminierungstechniken, die verwendet werden, um Kontrast in einer Probe von zu erzeugen Taschentuch. 1,559 μm/Pixel.
• 

  Helles Feld Beleuchtung, Probenkontrast kommt von Absorption Licht in der Probe.

• 

  Kreuzpolarisiertes Licht Beleuchtung, Probenkontrast kommt von der Rotation von polarisiert Licht durch die Probe.

• 

  Dunkles Feld Beleuchtung, Probenkontrast kommt vom Licht verstreut durch die Probe.

• 

  Phasenkontrast Beleuchtung, Probenkontrast kommt von Interferenz von verschiedenen Pfadlängen des Lichts durch die Probe.

Andere Techniken

Moderne Mikroskope ermöglichen mehr als nur die Beobachtung des übertragenen Lichtbildes einer Probe; Es gibt viele Techniken, mit denen andere Datenarten extrahiert werden können. Die meisten von ihnen erfordern zusätzlich zu einem grundlegenden Verbindungsmikroskop zusätzliches Gerät.

• Reflektiertes Licht oder Zwischenfall, Beleuchtung (zur Analyse von Oberflächenstrukturen)
• Fluoreszenzmikroskopie beide:

• Epifluoreszenzmikroskopie
• Konfokale Mikroskopie

• Mikrospektroskopie (wobei ein UV-sichtbarer Spektrophotometer in ein optisches Mikroskop integriert ist)
• Ultraviolette Mikroskopie
• Nahinfrarotmikroskopie
• Mehrfachübertragungsmikroskopie^[29] zur Kontrastverstärkung und Verringerung der Aberration.
• Automatisierung (zum automatischen Scannen einer großen Stichprobe oder einer Bildaufnahme)

Anwendungen

Ein 40 -fach -Vergrößerungsbild von Zellen in einer medizinischen Abstrich durch ein optisches Mikroskop mit a durchgenommen Nasspräparat Technik, das Probe auf einen Glasrutschen und Mischen mit einer Salzlösung

Die optische Mikroskopie wird ausgiebig in Mikroelektronik, Nanophysik, Biotechnologie, pharmazeutischer Forschung, Mineralogie und Mikrobiologie verwendet.^[30]

Die optische Mikroskopie wird für verwendet medizinische Diagnose, das Feld wird bezeichnet Histopathologie Beim Umgang mit Geweben oder in Schmiertests auf freien Zellen oder Gewebefragmenten.

Im industriellen Gebrauch sind binokulare Mikroskope häufig. Abgesehen von Anwendungen, die true benötigen TiefenwahrnehmungDie Verwendung doppelter Augenmerkmale verringert sich Überanstrengung der Augen verbunden mit langen Arbeitstagen in einer Mikroskopiestation. In bestimmten Anwendungen, langjährige Distanz oder Langfokus-Mikroskope^[31] sind vorteilhaft. Ein Artikel muss möglicherweise hinter a untersucht werden Fensteroder industrielle Themen können eine Gefahr des Ziels darstellen. Solche Optiken ähneln Teleskopen mit engen Fokusfähigkeiten.^[32][33]

Messmikroskope werden zur Präzisionsmessung verwendet. Es gibt zwei Grundtypen. Man hat a Fadenkreuz Abschluss, um die Messung der Entfernungen in der Brennebene zu ermöglichen.^[34] Der andere (und ältere) Typ hat einfach Fadenkreuze und ein Mikrometermechanismus zum Bewegen des Subjekts relativ zum Mikroskop.^[35]

Sehr kleine, tragbare Mikroskope haben an Orten, an denen ein Labormikroskop eine Belastung wäre, eine gewisse Verwendung gefunden.^[36]

Einschränkungen

Die Beugungsgrenze in einem Denkmal in Stein festgesetzt für Ernst Abbe.

Bei sehr hohen Vergrößerungen mit übertragenem Licht werden Punktobjekte als Fuzzy -Scheiben angesehen, die von umgeben sind Beugung Ringe. Diese nennt man Luftige Festplatten. Das Auflösungsvermögen eines Mikroskops wird als die Fähigkeit angesehen, zwischen zwei eng verteilten luftigen Scheiben zu unterscheiden (oder mit anderen Worten die Fähigkeit des Mikroskops, benachbarte strukturelle Details als unterschiedlich und getrennt) zu unterscheiden. Es sind diese Auswirkungen der Beugung, die die Fähigkeit einschränken, feine Details zu beheben. Das Ausmaß und die Größe der Beugungsmuster werden durch beide beeinflusst Wellenlänge von hell (λ), die Brechungsmaterialien, die zur Herstellung der Objektivlinse verwendet werden und die Numerische Blende (Na) der objektiven Linse. Es gibt daher eine begrenzte Grenze, ab denen es unmöglich ist, getrennte Punkte im Zielfeld zu lösen, das als das bezeichnet wird Beugungsgrenze. Angenommen, optische Aberrationen im gesamten optischen Aufbau sind vernachlässigbar, die Auflösung d, kann angegeben werden als:

${\ displayStyle d = {\ frac {\ lambda} {2na}}}$

Normalerweise wird eine Wellenlänge von 550 nm angenommen, was entspricht grün hell. Mit Luft Als externes Medium das höchste praktische Praktikum N / A ist 0,95 und mit Öl bis zu 1,5. In der Praxis der niedrigste Wert von d Die mit konventionellen Objektiven erhältlichen Objektiven beträgt etwa 200 nm. Eine neue Art von Objektiv unter Verwendung mehrerer Lichtstreuung konnte die Auflösung auf unter 100 nm verbessern.^[37]

Übertretung der Auflösungsgrenze

Es stehen mehrere Techniken zur Verfügung, um Auflösungen höher zu erreichen als die oben beschriebene übertragene Lichtgrenze. Holographische Techniken, wie von Courjon und Bulabois 1979 beschrieben, sind auch in der Lage, diese Auflösungsgrenze zu brechen, obwohl die Auflösung in ihrer experimentellen Analyse eingeschränkt war.^[38]

Verwenden von fluoreszierenden Proben sind mehr Techniken verfügbar. Beispiele beinhalten Vertico smi, optische Mikroskopie in der Nähe des Feldes was verwendet Evaneszierwellen, und Stimulierte Emissionsabreicher. Im Jahr 2005 wurde ein Mikroskop, das ein einzelnes Molekül nachweisen kann, als Lehrwerkzeug beschrieben.^[39]

Trotz signifikanter Fortschritte im letzten Jahrzehnt bleiben Techniken zur Übertreibung der Beugungsgrenze begrenzt und spezialisiert.

Während sich die meisten Techniken auf Erhöhungen der lateralen Auflösung konzentrieren, gibt es auch einige Techniken, die eine Analyse extrem dünner Proben ermöglichen. Zum Beispiel, Sarfus Methoden legen die dünne Probe auf eine kontrastverstärkende Oberfläche und ermöglicht dadurch die direkten Visualisierung von Filmen wie 0,3 Nanometern.

Am 8. Oktober 2014 die Nobelpreis für Chemie wurde vergeben an Eric Betzig, William Moerner und Stefan Hölle Für die Entwicklung von superauflösender Fluoreszenzmikroskopie.^[40][41]

Strukturierte Beleuchtung SMI

SMI (räumlich modulierte Beleuchtungsmikroskopie) ist ein leichter optischer Prozess der sogenannten Punktverbreitungsfunktion (PSF) Engineering. Dies sind Prozesse, die das PSF von a ändern Mikroskop in geeigneter Weise, um entweder die optische Auflösung zu erhöhen, um die Präzision von zu maximieren Distanz Messungen von fluoreszierenden Objekten, die im Vergleich zur kleinen kleinen Personen klein sind Wellenlänge des aufschlussreichen Lichts oder um andere Strukturparameter im Nanometerbereich zu extrahieren.^[42][43]

Lokalisierungsmikroskopie SPDMPHYMOD

3d Dual Color Super -Auflösung Mikroskopie mit HER2 und HER3 in Brustzellen, Standardfarbstoffe: Alexa 488, Alexa 568 Limon

SPDM (spektrale Präzisionsabstandmikroskopie), die grundlegende Lokalisierungsmikroskopie -Technologie ist ein leichter optischer Prozess von Fluoreszenzmikroskopie Dies ermöglicht Position, Abstand und Winkelmessungen an "optisch isolierten" Partikeln (z. B. Molekülen) deutlich unter der theoretischen Auflösungsgrenze für Lichtmikroskopie. "Optisch isoliert" bedeutet, dass zu einem bestimmten Zeitpunkt nur ein einzelnes Partikel/Molekül innerhalb einer Region einer Größe durch herkömmliche optische Auflösung bestimmt wird (typischerweise ca. 200–250 nm Durchmesser) wird registriert. Dies ist möglich, wenn Moleküle Innerhalb einer solchen Region tragen alle unterschiedliche Spektralmarker (z. B. verschiedene Farben oder andere nutzbare Unterschiede in der Lichtemission von verschiedenen Partikeln).^{[44][45][46][47]}

Viele Standardfluoreszenzfarbstoffe mögen GFP, Alexa-Farbstoffe, ATTO-Farbstoffe, Cy2/Cy3 und Fluorescein-Moleküle können zur Lokalisierungsmikroskopie verwendet werden, sofern bestimmte physische physikalische Bedingungen vorliegen. Mit dieser sogenannten SPDMPHYMOD-Technologie (physikalisch modifizierbare Fluorophore) ist eine einzelne Laserwellenlänge geeigneter Intensität für Nanoimaging ausreichend.^[48]

3D -Superauflösung Mikroskopie

3D -Superauflösungsmikroskopie mit Standardfluoreszenzfarbstoffen kann durch Kombination der Lokalisationsmikroskopie für Standard -Fluoreszenzfarbstoffe SPDMPHYMOD und strukturierter Beleuchtung SMI erreicht werden.^[49]

Stand

Stimulierte Emissionsabbau (STED) -Mikroskopiebild von Aktinfilamenten in einer Zelle.

Stimulierte Emissionsabreicher ist ein einfaches Beispiel dafür, wie eine höhere Auflösung, die die Beugungsgrenze übertrifft, möglich ist, aber es hat große Einschränkungen. STED ist eine Fluoreszenzmikroskopie-Technik, bei der eine Kombination von Lichtimpulsen verwendet wird, um Fluoreszenz in einer kleinen Subpopulation von fluoreszierenden Molekülen in einer Probe zu induzieren. Jedes Molekül erzeugt eine Beugungsbeschränkung des Lichts im Bild, und die Mitte jeder dieser Stellen entspricht der Position des Moleküls. Da die Anzahl der fluoreszierenden Moleküle niedrig ist, ist es unwahrscheinlich, dass sich die Lichtflecken überlappen und daher genau platziert werden können. Dieser Vorgang wird dann oft wiederholt, um das Bild zu generieren. Stefan Hölle Das Max -Planck -Institut für biophysikalische Chemie wurde 2006 mit dem 10. deutschen zukünftigen Preis und 2014 für seine Entwicklung des STED -Mikroskops und der damit verbundenen Methoden für Chemie für Chemie ausgezeichnet.^[50]

Alternativen

Um die durch die Beugungsgrenze von sichtbaren Licht festgelegten Einschränkungen zu überwinden, wurden andere Mikroskope entworfen, die andere Wellen verwenden.

• Atomkraftmikroskop (AFM)
• Rasterelektronenmikroskop (SEM)
• Scan-Ionen-Leitungsmikroskopie (Sicm)
• Rastertunnelmikroskop (STM)
• Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
• Ultraviolettes Mikroskop
• Röntgenmikroskop

Es ist wichtig zu beachten, dass höhere Frequenzwellen nur eine begrenzte Wechselwirkung mit Materie aufweisen, beispielsweise Weichteilgewebe für Röntgenstrahlen relativ transparent, was zu unterschiedlichen Kontrastquellen und unterschiedlichen Zielanwendungen führt.

Die Verwendung von Elektronen und Röntgenstrahlen anstelle von Licht ermöglicht eine viel höhere Auflösung-die Wellenlänge der Strahlung ist kürzer, sodass die Beugungsgrenze niedriger ist. Um die Kurzwellenlängensonde nicht zu zerstörerisch zu machen, das Atomstrahlbildgebungssystem (Atom -Nanoskop) wurde in der Literatur vorgeschlagen und weit verbreitet, aber es ist noch nicht wettbewerbsfähig mit herkömmlichen Bildgebungssystemen.

STM und AFM sind Scan -Sondentechniken unter Verwendung einer kleinen Sonde, die über die Probenoberfläche gescannt wird. Die Auflösung in diesen Fällen ist durch die Größe der Sonde begrenzt; Mikromachining -Techniken können Sonden mit Spitzenradien von 5–10 nm erzeugen.

Darüber hinaus verwenden Methoden wie Elektronen- oder Röntgenmikroskopie ein Vakuum oder ein partielles Vakuum, das ihre Verwendung für lebende und biologische Proben einschränkt (mit Ausnahme eines Umgebungs -Rasterelektronenmikroskop). Die für alle dieser Instrumente benötigten Probenkammern begrenzen auch die Stichprobengröße und die Probenmanipulation ist schwieriger. Farbe kann in Bildern nicht gesehen werden, die mit diesen Methoden gemacht wurden, daher gehen einige Informationen verloren. Sie sind jedoch bei der Untersuchung von molekularen oder atomaren Wirkungen von wesentlicher Bedeutung, wie z. Altersverhärtung in Aluminiumlegierungen, oder der Mikrostruktur von Polymere.

Siehe auch

Verweise

Zitierte Quellen

• Van Held, Albert; Dupre, Sven; Van Gent, Rob (2011). Die Ursprünge des Teleskops. Amsterdam University Press. ISBN 978-9069846156.

Weitere Lektüre

• "Metallographische und materialografische Probenpräparation, Lichtmikroskopie, Bildanalyse und Härteprüfung", Kay Geels in Zusammenarbeit mit Struers A/S, ASTM International 2006.
• "Lichtmikroskopie: Eine anhaltende zeitgenössische Revolution", Siegfried Weisenburger und Vahid Sandoghdar, Arxiv: 1412.3255 2014.

Externe Links

• Antike Mikroskope und wissenschaftliche Instrumente Ein Ort über antike Mikroskope, ihr Zubehör und der Geschichte
• Antike microskopes.com Eine Sammlung von frühen Mikroskopen
• Historische Mikroskope, eine illustrierte Sammlung mit mehr als 3000 Fotos von wissenschaftlichen Mikroskopen durch europäische Hersteller (auf Deutsch)
• Die Golub -Sammlung, Eine Sammlung von Mikroskopen des 17. bis 19. Jahrhunderts, einschließlich umfangreicher Beschreibungen
• Molekulare AusdrückeKonzepte in der optischen Mikroskopie
• Online -Tutorial für praktische optische Mikroskopie
• OpenWetware
• Zellzentrierte Datenbank