Molekularbiologie

"Biochemische Genetik" leitet hier weiter. Für das wissenschaftliche Journal siehe Biochemische Genetik (Journal).
"Molekulare Mikrobiologie" leitet hier weiter. Für das wissenschaftliche Journal siehe Molecular Microbiology (journal).

Molekularbiologie /məˈlɛkjʊlər/ ist der Zweig von Biologie das versucht das zu verstehen Molekular Basis der biologischen Aktivität in und zwischen Zellen, einschließlich Molekular Synthese, Modifikation, Mechanismen und Wechselwirkungen.[1][2][3] Die Untersuchung der chemischen und physikalischen Struktur biologischer Makromoleküle ist als molekulare Biologie bekannt.[4]

Die Molekularbiologie wurde zunächst als Ansatz beschrieben, der sich auf die Grundlagen biologischer Phänomene konzentrierte und die Strukturen biologischer Moleküle sowie deren Wechselwirkungen aufdeckt und wie diese Wechselwirkungen Beobachtungen der klassischen Biologie erklären.[5]

1945 wurde der Begriff molekulare Biologie von Physiker William Astbury verwendet. Die Entwicklung im Bereich der molekularen Biologie ereignete sich sehr spät, als zu verstehen, dass das komplexe System oder das vorteilhafte Ansatz in einfacher Verständnis durch Verwendung von Bakterien und Bakteriophagen durchgeführt werden. Dieser Organismus liefert Informationen über den biologischen grundlegenden Prozess leichter als Tierzellen. Im Jahr 1953 arbeiteten zwei junge Männer namens Francis Crick und James Watson, die bei der Abteilung für Medical Research Council, Cavendish Laboratory, Cambridge (jetzt die MRC Labor für Molekularbiologie), machte ein Doppelhelixmodell der DNA, das das gesamte Forschungsszenario veränderte. Sie schlugen die DNA -Struktur basierend auf früheren Untersuchungen vor, die von Rosalind Franklin und Maurice Wilkins durchgeführt wurde, und die Forschung führt dazu, dass das DNA -Material in anderen Mikroorganismen, Pflanzen und Tieren gefunden wurde.[4]

Molekulare Biologie ist nicht nur die Untersuchung biologischer Moleküle und ihrer Wechselwirkungen; Vielmehr ist es auch eine Sammlung von Techniken, die seit der Entstehung des Feldes entwickelt wurden und es Wissenschaftlern ermöglicht haben, etwas über molekulare Prozesse zu lernen.[6] Eine bemerkenswerte Technik, die das Feld revolutioniert hat, ist die 1983 entwickelte Polymerasekettenreaktion (PCR).[6] PCR ist eine Reaktion, die kleine Mengen an DNA verstärkt und in vielen Anwendungen über wissenschaftliche Disziplinen hinweg verwendet wird, wie später diskutiert wird.[7][8]

Das zentrales Dogma der molekularen Biologie beschreibt den Prozess, bei dem DNA in RNA transkribiert wird, was dann in Protein übersetzt wird.[2][9]

Die Molekularbiologie spielt auch eine entscheidende Rolle beim Verständnis von Strukturen, Funktionen und internen Kontrollen innerhalb des Einzelnen ZellenAll dies kann verwendet werden, um neu zu zielen DrogenKrankheit diagnostizieren und die Zellphysiologie besser verstehen.[10] Einige klinische Forschung und medizinische Therapien, die sich aus der molekularen Biologie ergeben Gentherapie während die Verwendung der molekularen Biologie oder Molekulare Zellbiologie in der Medizin wird jetzt als bezeichnet als Molekulare Medizin.

Geschichte der Molekularbiologie

Hauptartikel: Geschichte der Molekularbiologie

Molekulare Biologie befindet sich an der Schnittstelle von Biochemie und Genetik; Als diese wissenschaftlichen Disziplinen im 20. Jahrhundert entstanden und entwickelten, wurde klar, dass beide die molekularen Mechanismen bestimmen wollten, die lebenswichtige zelluläre Funktionen zugrunde liegen.[11] Fortschritte in der molekularen Biologie waren eng mit der Entwicklung neuer Technologien und ihrer Optimierung verbunden.[12] Die molekulare Biologie wurde durch die Arbeit vieler Wissenschaftler erläutert, und daher hängt die Geschichte des Feldes vom Verständnis dieser Wissenschaftler und ihrer Experimente ab.

Alles beginnt mit dem Phänomen der Transformation in den Bakterien. 1928 beobachtete Frederick Griffith ein Phänomen der Transformation von einem Bakterium zu einem anderen [heute als genetische Transformation bezeichnete]. Zu dieser Zeit konnte er das Phänomen der Transformation nicht erklären. Später im Jahr 1944 zeigten drei Wissenschaftler Oswald Avery, Colin MacLeod und Maclyn McCarty das gesamte Phänomen der Transformation in den Bakterien. Nach zwei Jahren im Jahr 1930 wurde die molekulare Biologie als offizieller Wissenschaftszweig eingerichtet. Der Begriff „Molekularbiologie“ wurde jedoch erst 1938 geprägt und der Wissenschaftler Warren Weaver, der als Direktor für Naturwissenschaften bei der Rockefeller Foundation arbeitete.[4]

Aus dem folgenden Experiment wurde der Schluss gezogen, dass DNA das grundlegende genetische Material ist, das die genetischen Veränderungen verursachte. Die Grundzusammensetzung der DNA war bekannt, dass sie vier Basen enthält, die als Adenin, Guanin, Thymin und Cytosin bekannt sind. Also wurde auf den Basen der chemischen Zusammensetzung und der Röntgenkristallographie von Maurice Wilkins und Rosalind Franklin die DNA-Struktur von James Watson und Francis Crick vorgeschlagen. Doch bevor der Watson und Crick die DNA-Struktur vorschlugen, schlug 1950 in Österreicher geborener Wissenschaftler Erwin Chargaff die Theorie / Regel [heute bekannt Anteil.[4]

Die Regel des Chargaffs

"Die Regel von Chargaff hat diese DNA festgestellt von allen Arten eines Organismus sollte ein 1: 1 -stöchiometrisches Verhältnis von haben Purine und Pyrimidine (d. H. A+G = T+C) und insbesondere das die Menge von Guanine sollte gleich sein Zytosin und die Menge an Adenin sollte gleich sein Thymin. Dieses Muster findet sich in beiden Strängen der DNA ".[4]

Das Gebiet der Genetik entstand als Versuch, die molekularen Mechanismen von zu verstehen Genetischer Vererbung und die Struktur von a Gen. Gregor Mendel Pionierarbeit in dieser Arbeit im Jahr 1866, als er zum ersten Mal die Gesetze der genetischen Erbe schrieb, basierend auf seinen Studien zu Paarungskreuzen in Erbsenpflanzen.[13] Ein solches Gesetz der genetischen Vererbung ist das Gesetz der Segregation, was angibt, dass diploide Personen mit zwei Allele denn ein bestimmtes Gen wird eines dieser Allele an ihre Nachkommen übergeben.[14] Aufgrund seiner kritischen Arbeit wird das Studium der genetischen Vererbung allgemein als als bezeichnet Mendelsche Genetik.[15]

Ein Hauptmeilenstein in der molekularen Biologie war die Entdeckung der Struktur der DNA. Diese Arbeit begann 1869 von 1869 von Friedrich Miescher, ein Schweizer Biochemiker, der zum ersten Mal eine Struktur genannt hat Nuclein, was wir jetzt als Desoxyribonukleinsäure oder DNA kennen.[16] Er entdeckte diese einzigartige Substanz, indem er die Komponenten von mit Eiter gefüllten Bandagen untersuchte und die einzigartigen Eigenschaften der "phosphorhaltigen Substanzen" feststellte.[17] Ein weiterer bemerkenswerter Beitrag zum DNA -Modell war Phoebus levene, der 1919 das "Polynukleotidmodell" der DNA infolge seiner biochemischen Experimente an Hefe vorschlug.[18] Im Jahr 1950, Erwin Chargaff Auf der Arbeit von Levene erweitert und einige kritische Eigenschaften von Nukleinsäuren aufgeklärt: Erstens variiert die Sequenz der Nukleinsäuren zwischen den Spezies.[19] Zweitens ist die Gesamtkonzentration von Purinen (Adenin und Guanin) immer gleich der Gesamtkonzentration von Pyrimidinen (Cystein und Thymin).[16] Dies ist jetzt als Chargaffs Regel bekannt. 1953, James Watson und Francis Crick veröffentlichte die doppelte helikale Struktur von DNA,[20] Verwendung der Röntgenkristallographie Arbeit erledigt bis Rosalind Franklin und Maurice Wilkins. Watson und Crick beschrieben die Struktur der DNA und vermuteten die Auswirkungen dieser einzigartigen Struktur für mögliche Mechanismen der DNA -Replikation.[20]

J. D. Watson und F. H. C. Crick wurden 1962 zusammen mit Maurice Wilkens den Nobelpreis ausgezeichnet, um ein Modell der Struktur der DNA vorzuschlagen.[4]

Im Laufe der Zeit entdeckten K. A. Marcker und Frederick Sanger 1964 eine eigenartige Amiocyl-tRNA in E. coli, die als N-Formyl-Methionyl-tRNA bezeichnet wird, und erklärte, dass dieses Molekül eine Rolle im besonderen Mechanismus der Kettenverlängerung spielt. Er erhielt den zweiten Nobelpreis für die Entdeckung einer vollständigen Sequenz von 5.400 Nukleotiden einzelner gestrandeter DNA von F ´ 174 Bakteriophagen.[4]

1961 wurde gezeigt, dass wenn a Gen codiert a Protein, drei sequenzielle Basen eines Gens DNA Geben Sie jede aufeinanderfolgende Aminosäure des Proteins an.[21] Und so kam es dass der genetischer Code ist ein Triplettcode, in dem jedes Triplett (Codon genannt) eine bestimmte Aminosäure angibt. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass sich die Codons in der DNA -Sequenz, die ein Protein kodiert, nicht miteinander überlappen, und dass jede Sequenz von einem festen Startpunkt aus gelesen wird.

In den Jahren 1962 bis 1964 durch die Verwendung von bedingten letalen Mutanten eines Bakterienvirus,,[22] Grundlegende Fortschritte wurden in unserem Verständnis der Funktionen und Wechselwirkungen der in der Maschinerie von verwendeten Proteinen erzielt DNA Replikation, DNA -Reparatur, DNA -Rekombinationund im Zusammenbau molekularer Strukturen.

Diagrammatische Darstellung der DNA -Struktur von Watson und Crick
Winkelbeschreibung in der DNA -Struktur

Das F.Griffith -Experiment

Diagrammatische Darstellung des Experiments
Hauptartikel: Griffiths Experiment

1928 stieß Fredrick Griffith auf eine Virulenzeigenschaft in Pneumokokkenbakterien, die Laborratten tötete. Laut Mendel, der zu diesem Zeitpunkt weit verbreitet ist, konnte der Gentransfer nur von Eltern zu Tochterzellen auftreten. Griffith förderte eine andere Theorie und stellte fest, dass der Gentransfer im Mitglied derselben Generation als horizontaler Gentransfer (HGT) bekannt ist. Dieses Phänomen wird nun als genetische Transformation bezeichnet.

Griffith sprach sich an Streptococcus pneumoniae Bakterien, die zwei verschiedene Stämme hatten, eine virulent und glatt und eine avirulent und rau. Der glatte Stamm hatte aufgrund des Vorhandenseins einer Art von spezifischem Polysaccharid - einem Polymer aus Glucuronsäurekapsel - ein gliedes Erscheinungsbild. Aufgrund dieser Polysaccharidschicht von Bakterien kann das Immunsystem eines Wirts die Bakterien nicht erkennen und tötet den Wirt ab. Dem anderen, avirulenten, rauen Stamm fehlt diese Polysaccharidkapsel und hat ein stumpfes, raues Aussehen.

Das Vorhandensein oder Abwesenheit von Kapsel im Stamm ist bekanntermaßen genetisch bestimmt. In mehreren verschiedenen Typen treten glatte und grobe Stämme auf, wie S-I, S-II, S-III usw. bzw. R-I, R-II, R-III usw. All diese Subtypen von S- und R -Bakterien unterscheiden sich in Antigentypen, die sie produzieren, miteinander.[4]

Hershey und Chase -Experiment

Hauptartikel: Hershey -Chase -Experiment
Hershey und Chase -Experiment

Bestätigung, dass DNA das genetische Material ist, das Ursache für Infektionen ist, stammt aus Hershey und Chase -Experiment. Sie benutzten E coli und Bakteriophage für das Experiment. Dieses Experiment ist auch als Blender -Experiment bekannt, da der Küchenmixer als wichtiges Stück Apparat verwendet wurde. Alfred Hershey und Martha Chase zeigten, dass die DNA, die von einem Phagenpartikel in ein Bakterium injiziert wurde, alle Informationen enthält, die zur Synthese von Nachkommen -Phagen -Partikeln erforderlich sind. Sie verwendeten Radioaktivität, um die Proteinschicht des Bakteriophagen mit radioaktivem Schwefel und DNA mit radioaktivem Phosphor in zwei verschiedene Testrohre zu markieren. Nach dem Mischen von Bakteriophagen und E coli In das Testrohr beginnt die Inkubationszeit, in der Phagen das genetische Material in der E coli Zellen. Dann wird die Mischung gemischt oder aufgeregt, was den Phagen von trennt E coli Zellen. Die gesamte Mischung ist zentrifugiert und das Pellet, das enthält E coli Die Zellen wurden überprüft und der Überstand wurde verworfen. Das E coli Die Zellen zeigten radioaktives Phosphor, was darauf hinwies, dass das transformierte Material DNA nicht die Proteinschicht war.

Die transformierte DNA wird an die DNA von gebunden E coli und Radioaktivität wird nur auf der DNA des Bakteriophagens gesehen. Diese mutierte DNA kann an die nächste Generation übergeben und die Theorie der Transduktion entstanden. Die Transduktion ist ein Prozess, bei dem die bakterielle DNA das Fragment von Bakteriophagen trägt und es an der nächsten Generation weitergibt. Dies ist auch eine Art horizontaler Gentransfer.[4]

Moderne molekulare Biologie

Wenn wir uns der Mitte der 20er Jahre nähern, tritt die molekulare Biologie in ein goldenes Zeitalter ein, das sowohl durch vertikale als auch durch horizontale technische Entwicklung definiert ist. Vertikal ermöglichen neuartige Technologien die Echtzeitüberwachung biologischer Prozesse auf Atomebene.[23] Molekulare Biologen haben heute Zugang zu immer erschwinglichen Sequenzierungsdaten in immer höheren Tiefen und erleichtern die Entwicklung neuer genetischer Manipulationsmethoden in neuen Nichtmodellorganismen. Ebenso werden synthetische molekulare Biologen die industrielle Produktion kleiner und Makromoleküle durch die Einführung exogener Stoffwechselwege in verschiedenen prokaryotischen und eukaryotischen Zelllinien vorantreiben.[24]

Horizontal werden Sequenzierungsdaten erschwinglicher und werden in vielen verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen genutzt. Dies wird die Entwicklung von Branchen in Entwicklungsländern vorantreiben und die Zugänglichkeit für einzelne Forscher erhöhen. Ebenso können CRISPR-Cas9-Gen-Bearbeitungsexperimente nun von Einzelpersonen für unter 10.000 US-Dollar in neuartigen Organismen konzipiert und umgesetzt werden, die die Entwicklung von Industrie- und medizinischen Anwendungen vorantreiben werden [25]

Beziehung zu anderen biologischen Wissenschaften

Schematische Beziehung zwischen Biochemie, Genetik und molekulare Biologie

Die folgende Liste beschreibt einen Standpunkt zu den interdisziplinären Beziehungen zwischen molekularer Biologie und anderen verwandten Bereichen.[26]

  • Molekularbiologie ist die Untersuchung der molekularen Grundlagen der biologischen Phänomene, die sich auf die molekulare Synthese, Modifikation, Mechanismen und Wechselwirkungen konzentrieren.
  • Biochemie ist die Untersuchung der chemischen Substanzen und lebenswichtigen Prozesse im Leben Organismen. Biochemisten Konzentrieren Sie sich stark auf die Rolle, Funktion und Struktur von Biomoleküle wie zum Beispiel Proteine, Lipide, Kohlenhydrate und Nukleinsäuren.[27]
  • Genetik ist die Untersuchung, wie genetische Unterschiede die Organismen beeinflussen. Genetik Versuche vorherzusagen, wie Mutationen, Individuell Gene und Genetische Wechselwirkungen kann den Ausdruck von a beeinflussen Phänotyp[28]

Während Forscher Techniken praktizieren, die für die molekulare Biologie spezifisch sind, ist es üblich, diese mit Methoden aus zu kombinieren Genetik und Biochemie. Ein Groß Bioinformatik und Computerbiologie. Molekulare GenetikDie Untersuchung der Genstruktur und -funktion gehört seit den frühen 2000er Jahren zu den bekanntesten Unterfeldern der Molekularbiologie. Andere Biologiezweige werden durch molekulare Biologie informiert, indem entweder die Wechselwirkungen von Molekülen in ihrem eigenen Recht direkt untersucht werden, wie z. Zellen-Biologie und Entwicklungsbiologieoder indirekt, wo molekulare Techniken verwendet werden, um historische Eigenschaften von zu schließen Populationen oder Spezieswie in Feldern in Evolutionsbiologie wie zum Beispiel Populationsgenetik und Phylogenetik. Es gibt auch eine lange Tradition des Studiums Biomoleküle "von Grund auf" oder molekular in Biophysik.[29]

Techniken der molekularen Biologie

DNA -Animation
Eine umfangreichere Liste zu Proteinmethoden finden Sie unter Proteinmethoden. Weitere umfangreichere Liste zu Nukleinsäuremethoden finden Sie unter Nukleinsäuremethoden.

Molekulares Klonen

Hauptartikel: Molekulares Klonen
Transduktionsbild

Die molekulare Klonierung wird verwendet, um eine DNA -Sequenz von Interesse in einen Plasmidvektor zu isolieren und dann zu übertragen.[30] Diese rekombinante DNA -Technologie wurde erstmals in den 1960er Jahren entwickelt.[31] In dieser Technik a DNA Sequenz, die für ein interessierendes Protein kodieren, ist geklont Verwendung Polymerase Kettenreaktion (PCR) und/oder Restriktionsenzyme, in ein Plasmid (Ausdrucksvektor). Der Plasmidvektor hat normalerweise mindestens 3 charakteristische Merkmale: einen Ursprung der Replikation, a Mehrere Klonen (MCS) und ein selektiver Marker (normalerweise Antibiotika Resistenz). Zusätzlich sind stromaufwärts der MCs die Promoterregionen und die Transkription Startort starten, die die Expression des geklonten Gens regulieren.

Dieses Plasmid kann entweder in bakterielle oder in tierische Zellen eingeführt werden. Die Einführung von DNA in Bakterienzellen kann durch erfolgen Transformation Über Aufnahme von nackter DNA, Konjugation über den Zellzellkontakt oder durch Transduktion über viralen Vektor. Einführung von DNA in eukaryotisch Zellen wie tierische Zellen auf physikalische oder chemische Mittel werden genannt Transfektion. Es stehen verschiedene Transfektionstechniken zur Verfügung, wie z. B. Calciumphosphat -Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion und Liposomentransfektion. Das Plasmid kann in die integriert werden Genom, was zu einer stabilen Transfektion führt oder unabhängig vom Genom bleibt und vorübergehend exprimiert wird, als transiente Transfektion bezeichnet.[32][33]

DNA, die für ein interessierendes Protein kodiert, befindet sich jetzt in einer Zelle und die Protein kann jetzt ausgedrückt werden. Eine Vielzahl von Systemen, wie induzierbare Promotoren und spezifische Zellsignalfaktoren, stehen zur Verfügung, um das interessierende Protein in hohem Niveau auszudrücken. Große Mengen eines Proteins können dann aus der bakteriellen oder eukaryotischen Zelle extrahiert werden. Das Protein kann unter einer Vielzahl von Situationen auf enzymatische Aktivität getestet werden, das Protein kann so kristallisiert werden Tertiärstruktur Kann untersucht werden, oder in der pharmazeutischen Industrie kann die Aktivität neuer Arzneimittel gegen das Protein untersucht werden.[34]

Polymerase Kettenreaktion

Hauptartikel: Polymerase Kettenreaktion

Polymerase Kettenreaktion (PCR) ist eine äußerst vielseitige Technik zum Kopieren von DNA. Kurz gesagt, PCR erlaubt eine spezifische DNA -Sequenz auf vorgegebene Weise kopiert oder modifiziert werden. Die Reaktion ist extrem stark und könnte unter perfekten Bedingungen ein DNA -Molekül auf 1,07 Milliarden Moleküle in weniger als zwei Stunden verstärken. PCR hat viele Anwendungen, einschließlich der Untersuchung der Genexpression, des Nachweises von pathogenen Mikroorganismen, dem Nachweis genetischer Mutationen und der Einführung von Mutationen in DNA.[35] Die PCR -Technik kann verwendet werden, um einzuführen Restriktionsenzymstellen zu den Enden von DNA Stättengesteuerte Mutagenese. PCR kann auch verwendet werden, um festzustellen, ob ein bestimmtes DNA -Fragment in a gefunden wird cDNA -Bibliothek. PCR hat viele Variationen wie Reverse Transcription PCR (Reverse Transcription PCR (RT-PCR) zur Verstärkung von RNA und in jüngerer Zeit, Quantitative PCR die eine quantitative Messung von DNA- oder RNA -Molekülen ermöglichen.[36][37]

Zwei Prozent Agarosegel in Boratpufferguss in einer Gel Tablett.

Gelelektrophorese

SDS-PAGE
Hauptartikel: Gelelektrophorese

Gelelektrophorese ist eine Technik, die Moleküle durch ihre Größe unter Verwendung eines Agarose- oder Polyacrylamidgels trennt.[38] Diese Technik ist eines der Hauptwerkzeuge der molekularen Biologie. Das Grundprinzip ist, dass DNA -Fragmente durch Auftragen eines elektrischen Stroms über das Gel getrennt werden können. Da das DNA -Rückgrat negativ geladene Phosphatgruppen enthält, wandert die DNA gegen das positive Ende des Stroms durch das Agarosegel.[38] Proteine ​​können auch auf der Grundlage der Größe unter Verwendung eines getrennt werden SDS-PAGE Gel oder auf der Grundlage der Größe und ihrer elektrische Ladung Durch die Verwendung des sogenannten sogenannten als a 2D -Gelelektrophorese.[39]

Proteine, die auf einem Seitengel mit Coomassie -Blaufarbstoff gefärbt wurden.

Der Bradford -Assay

Hauptartikel: Der Bradford -Assay

Der Bradford -Assay ist eine molekulare Biologie -Technik, die die schnelle, genaue Quantifizierung von Proteinmolekülen unter Verwendung der einzigartigen Eigenschaften eines Farbstoffs ermöglicht, der genannt wird Coomassie Brilliant Blue G-250.[40] Coomassie Blue erfährt eine sichtbare Farbverschiebung von rotbraun zu hellblau nach Bindung an Protein.[40] Coomassie Blue hat in seinem instabilen kationischen Zustand eine Hintergrundwellenlänge von 465 nm und verleiht eine rotbraune Farbe.[41] Wenn Coomassie Blue in einer sauren Lösung an Protein bindet, verschiebt sich die Hintergrundwellenlänge auf 595 nm und der Farbstoff liefert eine hellblaue Farbe.[41] Proteine ​​im Assay binden Coomassie Blue in etwa 2 Minuten, und der Protein-Dye-Komplex ist etwa eine Stunde lang stabil, obwohl empfohlen wird, dass die Absorptionswerte innerhalb von 5 bis 20 Minuten nach der Reaktionsinitiation eingenommen werden.[40] Die Proteinkonzentration im Bradford -Assay kann dann mit einem sichtbaren Licht gemessen werden Spektrophotometerund benötigt daher keine umfangreiche Ausrüstung.[41]

Diese Methode wurde 1975 von entwickelt von Marion M. Bradfordund hat signifikant schneller und genauere Proteinquantifizierung im Vergleich zu früheren Methoden ermöglicht: das Lowry -Verfahren und den Biurett -Assay.[40] Im Gegensatz zu den vorherigen Methoden ist der Bradford-Assay nicht anfällig für Störungen durch mehrere Nicht-Protein-Moleküle, einschließlich Ethanol, Natriumchlorid und Magnesiumchlorid.[40] Es ist jedoch anfällig für Einfluss von starken alkalischen Puffergeräten, wie z. Natriumdodecylsulfat (SDS).[40]

Makromolekül -Blot- und Sondierung

Die Begriffe Nord, Western und Ost Blotting stammt aus dem, was zunächst ein molekularer Biologiewitz war, der auf dem Begriff gespielt wurde Southern Blotnach der Technik von beschrieben von Edwin Southern Für die Hybridisierung von geblotter DNA. Patricia Thomas, Entwicklerin des RNA -Blot, der dann als die bekannt wurde Northern BlotNutzte den Begriff eigentlich nicht.[42]

Southern Blot

Hauptartikel: Southern Blot

Benannt nach seinem Erfinder, Biologe Edwin Southern, das Southern Blot ist eine Methode zur Untersuchung des Vorhandenseins einer spezifischen DNA -Sequenz innerhalb einer DNA -Probe. DNA -Proben vor oder nachher Restriktionsenzym (Restriktionsendonuklease) Die Verdauung wird durch Gelelektrophorese getrennt und dann durch Blotting über eine Membran übertragen Kapillarwirkung. Die Membran wird dann einer markierten DNA -Sonde ausgesetzt, die eine Komplement -Basensequenz zur Sequenz der interessierenden DNA aufweist.[43] Southern Blot wird in der Laborwissenschaft aufgrund der Fähigkeit anderer Techniken, wie z. PCR, um spezifische DNA -Sequenzen aus DNA -Proben nachzuweisen. Diese Blots werden jedoch immer noch für einige Anwendungen verwendet, z. B. für die Messung Transgen Kopieren Sie die Nummer in Transgene Mäuse oder in der Technik von Gene Knockout Embryonale Stammzelllinien.[29]

Northern Blot

Hauptartikel: Northern Blot
Northern Blot Diagramm

Das Northern Blot wird verwendet, um das Vorhandensein spezifischer RNA -Moleküle als relatives Vergleich zwischen einer Reihe verschiedener RNA -Proben zu untersuchen. Es ist im Wesentlichen eine Kombination von Denaturierende RNA -Gelelektrophorese, und ein Blot. In diesem Prozess wird die RNA basierend auf der Größe getrennt und dann in eine Membran übertragen, die dann mit einem markierten untersucht wird ergänzen einer Sequenz von Interesse. Die Ergebnisse können je nach verwendeten Etikett auf verschiedene Weise visualisiert werden. Die meisten führen jedoch zur Enthüllung von Banden, die die Größen der in der Probe nachgewiesenen RNA darstellen. Die Intensität dieser Banden hängt mit der Menge der Ziel -RNA in den analysierten Proben zusammen. Das Verfahren wird üblicherweise verwendet, um zu untersuchen, wann und wie viel Genexpression auftritt, indem er misst, wie viel von dieser RNA in verschiedenen Proben vorhanden ist produziert. Es ist eines der grundlegendsten Instrumente, um zu welcher Zeit und unter welchen Bedingungen bestimmte Gene in lebenden Geweben exprimiert werden.[44][45]

Western Blot

Hauptartikel: westlicher Fleck

Ein Western Blot ist eine Technik, mit der bestimmte Proteine ​​aus einer Mischung aus Proteinen nachgewiesen werden können.[46] Western Blots können verwendet werden, um die Größe isolierter Proteine ​​zu bestimmen und deren Expression zu quantifizieren.[47] Im Western BlotProteine ​​werden zuerst durch Größe in einem dünnen Gel getrennt, das zwischen zwei Glasplatten in einer Technik bekannt ist als SDS-PAGE. Die Proteine ​​im Gel werden dann auf a übertragen Polyvinylidenfluorid (PVDF), Nitrocellulose, Nylon oder andere Stützmembran. Diese Membran kann dann mit Lösungen von untersucht werden Antikörper. Antikörper, die spezifisch an das interessierende Protein binden, können dann durch eine Vielzahl von Techniken, einschließlich farbiger Produkte, sichtbar gemacht werden. Chemilumineszenz, oder Autoradiographie. Oft sind die Antikörper mit Enzymen markiert. Wenn ein Chemilumineszenz Substrat ist dem ausgesetzt Enzym Es ermöglicht die Erkennung. Die Verwendung von Western -Blot -Techniken ermöglicht nicht nur die Erkennung, sondern auch die quantitative Analyse. Analoge Methoden zum Western Blot können verwendet werden, um spezifische Proteine ​​in Live direkt zu färben Zellen oder Gewebe Abschnitte.[46][48]

Eastern Blot

Hauptartikel: Eastern Blot

Das Eastern Blot Die Technik wird verwendet, um zu erkennen posttranslationale Modifikation von Proteinen. Proteine, die auf die PVDF- oder Nitrocellulose -Membran aufgetaucht sind, werden unter Verwendung spezifischer Substrate auf Modifikationen untersucht.[49]

Microarrays

Hauptartikel: DNA Microarray
Eine DNA -Microarray wird gedruckt
Hybridisierung des Ziels zu Sonde

A DNA Microarray ist eine Sammlung von Flecken, die an einer soliden Stütze wie a angeschlossen sind Mikroskop-Objektträger wobei jeder Punkt eine oder mehrere einsträngige DNA enthält Oligonukleotid Fragmente. Arrays ermöglichen es, große Mengen sehr kleiner (100 -Mikrometer -Durchmesser-) Flecken auf einen einzelnen Objektträger abzulegen. Jeder Punkt hat ein DNA -Fragmentmolekül, das zu einem einzigen ergänzt wird DNA -Sequenz. Eine Variation dieser Technik erlaubt dem Genexpression eines Organismus in einem bestimmten Stadium in der Entwicklung zu qualifizieren (Ausdrucksprofilerstellung). In dieser Technik wird die RNA in einem Gewebe isoliert und in markiert umgewandelt Komplementäre DNA (cDNA). Diese cDNA wird dann mit den Fragmenten des Arrays hybridisiert, und es kann eine Visualisierung der Hybridisierung erfolgen. Da mehrere Arrays mit genau der gleichen Position von Fragmenten hergestellt werden können, sind sie besonders nützlich, um die Genexpression von zwei verschiedenen Geweben wie einem gesunden und krebsartigen Gewebe zu vergleichen. Man kann auch messen, welche Gene exprimiert werden und wie sich diese Expression mit der Zeit oder mit anderen Faktoren verändert. Es gibt viele verschiedene Möglichkeiten zur Herstellung von Microarrays; Am häufigsten sind Siliziumchips, Mikroskop -Objektträger mit Flecken mit einem Durchmesser von ~ 100 Mikrometer, benutzerdefinierten Arrays und Arrays mit größeren Flecken an porösen Membranen (Makroarrays). In einem bestimmten Array kann es zwischen 100 Plätzen bis zu mehr als 10.000 geben. Arrays können auch mit anderen Molekülen als DNA hergestellt werden.[50][51][52][53]

Allelspezifischer Oligonukleotid

Hauptartikel: Allelspezifischer Oligonukleotid

Allelspezifischer Oligonukleotid (ASO) ist eine Technik, die die Erkennung von Einzelbasenmutationen ohne PCR- oder Gelelektrophorese ermöglicht. Kurzer (20–25 Nukleotide), markierte Sonden werden der nichtfragmentierten Ziel-DNA ausgesetzt. Die Hybridisierung tritt aufgrund der kurzen Länge der Sonden mit hoher Spezifität auf, und sogar eine einzelne Basenänderung behindert die Hybridisierung. Die Ziel -DNA wird dann gewaschen und die markierten Sonden, die nicht hybridisieren, werden entfernt. Die Ziel -DNA wird dann auf das Vorhandensein der Sonde durch Radioaktivität oder Fluoreszenz analysiert. In diesem Experiment muss wie bei den meisten molekularen Biologie -Techniken eine Kontrolle verwendet werden, um ein erfolgreiches Experimentieren zu gewährleisten.[54][55]

In der molekularen Biologie werden Verfahren und Technologien kontinuierlich entwickelt und ältere Technologien aufgegeben. Zum Beispiel vor dem Aufkommen der DNA Gelelektrophorese (Agarose oder Polyacrylamid) Die Größe der DNA -Moleküle wurde typischerweise durch Rate bestimmt Sedimentation in Saccharosegradienteneine langsame und arbeitsintensive Technik, die teure Instrumente erfordert; vor Saccharose -Gradienten, Visometrie wurde benutzt. Abgesehen von ihrem historischen Interesse ist es oft wert, über ältere Technologien zu wissen, da es gelegentlich nützlich ist, ein weiteres neues Problem zu lösen, für das die neuere Technik unangemessen ist.[56]

Siehe auch

Verweise

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