Kraftspektroskopie

Kraftspektroskopie ist eine Reihe von Techniken für die Untersuchung der Wechselwirkungen und der Bindungskräfte zwischen einzelnen Molekülen.[1][2] Diese Methoden können verwendet werden, um die mechanischen Eigenschaften von Single zu messen Polymer Moleküle oder Proteineoder individuell chemische Bindungen. Der Name "Kraft" Spektroskopie"Obwohl in der wissenschaftlichen Gemeinschaft weit verbreitet ist, ist es etwas irreführend, weil es keine wahre Interaktion mit Materiestrahlung gibt.[3]

Zu den Techniken, die zur Durchführung von Kraftspektroskopie verwendet werden können Rasterkraftmikroskopie,[2] Optische Pinzetten,[4] Magnetische Pinzette, akustische Kraftspektroskopie,[5] Mikronadeln,[6] und Biomembranen.[7]

Kraftspektroskopie misst das Verhalten eines Moleküls unter Dehnungs- oder Torsionsmechanik Macht. Auf diese Weise wurde in den letzten Jahren viel über die mechanochemische Kopplung in den verantwortlichen Enzymen gelernt Muskel Kontraktion, Transport in der Zelle, Energieerzeugung (F1-ATPase), DNA Replikation und Transkription (Polymerasen), DNA -Unterbrechung und Abwicklung (Topoisomerasen und Helikasen).

Als ein Einzelmolekül Technik im Gegensatz zu typischer Ensemble Spektroskopien ermöglicht es einem Forscher, die Eigenschaften des jeweiligen Moleküls zu bestimmen. Insbesondere können seltene Ereignisse wie Konformationsänderungen, die in einem Ensemble maskiert werden, beobachtet werden.

Versuchstechniken

Es gibt viele Möglichkeiten, einzelne Moleküle genau zu manipulieren. Unter diesen sind optische oder magnetische Pinzetten, Atom-Force-Microskop (AFM) -Inilever und akustische Kraftspektroskopie. In all diesen Techniken hat ein Biomolekül wie Protein oder DNA oder ein anderes Biopolymer ein Ende an eine Oberfläche und das andere an einen Kraftsensor. Der Kraftsensor ist normalerweise eine mikrometergroße Perle oder ein Ausleger, dessen Verschiebung gemessen werden kann, um die Kraft zu bestimmen.

Atomkraft -Mikroskop -Ausleger

Moleküle adsorbiert auf einen auftauchen werden von einer mikroskopischen Spitze (Nanometer breit) aufgenommen, die sich am Ende eines elastischen Auslegers befindet. In einer ausgefeilteren Version dieses Experiments (chemische Kraftmikroskopie) werden die Spitzen mit den interessierenden Molekülen kovalent funktionalisiert.[8] A piezoelektrisch Controller zieht dann den Ausleger hoch. Wenn eine Kraft auf den elastischen Ausleger wirkt (zum Beispiel, weil ein Molekül zwischen der Oberfläche und der Spitze gedehnt wird), wird dies nach oben (abstoßende Kraft) oder nach unten (attraktive Kraft) ablenken. Entsprechend Hookes GesetzDiese Ablenkung ist proportional zur Kraft, die auf den Ausleger wirkt. Die Ablenkung wird an der Position von a gemessen Laser- Strahl reflektiert vom Ausleger. Diese Art von Setup kann Kräfte messen, die nur 10 pn (10) messen können–11 N) Die grundlegende Auflösungsgrenze wird durch die Thermal des Auslegers angegeben Lärm.

Die sogenannte Kraftkurve ist das Diagramm der Kraft (oder genauer gesagt der Auslegerauslenkung) gegenüber der piezoelektrischen Position auf der Z-Achse. Ein idealer Hookean FrühlingZum Beispiel würde eine gerade diagonale Kraftkurve angezeigt. Typischerweise bestehen die in den Kraftspektroskopieexperimenten beobachteten Kraftkurven aus einem Kontaktbereich (diagonal), in dem die Sonde die Probenoberfläche kontaktiert, und einer nicht kontaktischen Region, in der die Sonde von der Probenoberfläche ist. Wenn die restaurierende Kraft des Auslegers überschreitet, dass die Adhäsionskraft der Spitze die Probe-Probe-Kraft überschreitet, springt die Sonde aus dem Kontakt heraus, und die Größe dieses Sprung wird häufig als Maß für die Adhäsionskraft oder die Bruchkraft verwendet. Im Allgemeinen ist das Bruch einer Spitzenoberfläche ein stochastischer Prozess; Daher erfordert eine zuverlässige Quantifizierung der Adhäsionskraft mehrere individuelle Kraftkurven. Das Histogramm der in diesen Mehrfachmessungen erhaltenen Adhäsionskräfte liefert die Hauptdatenausgabe für die Messung der Kraftspektroskopie.

In der Biophysik kann eine Einzelmolekülkraftspektroskopie verwendet werden, um die Energielandschaft zu untersuchen, die der Wechselwirkung zwischen zwei Biomolekülen wie Proteinen zugrunde liegt. Hier kann ein Bindungspartner über ein flexibles Linkermolekül (PEG -Kette) an eine Auslegerspitze angebracht werden, während der andere auf einer Substratoberfläche immobilisiert ist. In einem typischen Ansatz wird der Cantilever wiederholt mit konstanter Geschwindigkeit aus der Probe nähert und aus der Probe zurückgezogen. In einigen Fällen tritt eine Bindung zwischen den beiden Partnern auf, die in der Kraftkurve sichtbar werden, da die Verwendung eines flexiblen Linker zu einer charakteristischen Kurvenform führt (siehe Wurmartige Kette Modell) von Adhäsion unterscheidet. Die gesammelten Bruchkräfte können dann als Funktion der Bindungsladungsrate analysiert werden. Das resultierende Graphen der durchschnittlichen Bruchkraft als Funktion der Laderate wird als die als die als Funktion bezeichnet Kraftspektrum und bildet den grundlegenden Datensatz für Dynamische Kraftspektroskopie.[9][10]

Im idealen Fall einer einzelnen scharfen Energiebarriere für die Wechselwirkungen mit Spitzen-Stichproben zeigt das dynamische Kraftspektrum eine lineare Erhöhung der Bruchkraft als Funktion eines Logarithmus der Lastrate, wie durch ein von Bell et al. Vorgeschlagener Modell beschrieben.[11] Hier ist die Steigung des Bruchkraftspektrums gleich dem der , wo ist der Abstand vom Energie- minimal zum Übergangszustand. Bisher gibt es eine Reihe theoretischer Modelle, die die Beziehung zwischen Ladungsrate und Bruchkraft beschreiben, die auf unterschiedlichen Annahmen basieren und unterschiedliche Kurvenformen vorhersagen.[10][12]

Zum Beispiel verwendeten Ma X., Gosai A. et al., Dynamische Kraftspektroskopie zusammen mit molekularen Dynamiksimulationen, um die Bindungskraft zwischen Thrombin, einem Blutkoagulationsprotein und seinem DNA -Aptamer herauszufinden.[13]

Akustische Kraftspektroskopie

Eine kürzlich entwickelte Technik, ACustic Force Spectroscopy (AFS), ermöglicht die Kraftmanipulation von Hunderten von Einzelmolekülen und Einzelzellen parallel, was einen hohen experimentellen Durchsatz liefert.[5] In dieser Technik erregt ein Piezo -Element planare akustische Wellen über einen mikrofluidischen Chip. Die erzeugten akustischen Wellen sind in der Lage, Kräfte auf Mikrokugeln mit unterschiedlicher Dichte als das umgebende Medium auszuüben. Biomoleküle wie DNA, RNA oder Proteine ​​können einzeln zwischen den Mikrokugeln und einer Oberfläche gebunden und dann durch die vom Piezosensor ausgeübten akustischen Kräfte untersucht werden. Zellen können durch die akustischen Kräfte direkt oder durch Verwendung von Mikrokugeln als Griffe manipuliert werden.[14] Bei AFS-Geräten ist es möglich, Kräfte im Bereich von 0 bis mehrere Hundert Piconewtons auf Hunderten von Mikrokugeln anzuwenden und Kraft-Extensionskurven oder Histogramme von Bruchkräften vieler einzelner Ereignisse parallel zu erhalten.

Optische Pinzetten

Eine andere Technik, die für Einzelmolekül -Experimente an Boden gewonnen hat, ist die Verwendung von Optische Pinzetten zum Auftragen mechanischer Kräfte auf Moleküle. Ein stark fokussierter Laser- Strahl hat die Fähigkeit, Partikel (dielektrisches Material) in einem Größenbereich von Nanometern bis Mikrometern zu fangen und zu halten. Die Einfangwirkung von optischen Pinzetten resultiert aus der Dipol- oder optischen Gradientenkraft auf der dielektrischen Kugel. Die Technik, einen fokussierten Laserstrahl als Atomfalle zu verwenden, wurde erstmals 1984 bei Bell Laboratories angewendet. Bis dahin wurden Experimente mit entgegengesetzt gerichteten Lasern durchgeführt, um Partikel zu fangen. Spätere Experimente zeigten bei demselben Projekt bei Bell Laboratories und anderen seitdem eine schadenfreie Manipulation an Zellen unter Verwendung eines Infrarotlasers. Somit wurde der Boden für biologische Experimente mit optischem Fangen gemacht.

Jede Technik hat ihre eigenen Vor- und Nachteile. Zum Beispiel können AFM-Cantilevers Angstrom-Maßstäbe, Millisekundenereignisse und Kräfte von mehr als 10 pn messen. Während Glasmikrofasern eine solche feine räumliche und zeitliche Auflösung nicht erreichen können, können sie Piconewton -Kräfte messen. Optische Pinzetten ermöglichen die Messung von Piconewton -Kräften und Nanometerverschiebungen, was für viele biologische Experimente ein idealer Bereich ist. Magnetische Pinzetten können Femtonewton -Kräfte messen und außerdem können sie auch zur Anwendung von Torsion verwendet werden. AFS-Geräte ermöglichen die statistische Analyse der mechanischen Eigenschaften biologischer Systeme durch Anwenden von Piconewton-Kräften auf Hunderte einzelner Partikel parallel, wobei die Reaktionszeit der Untermillisekunden-Reaktion.

Anwendungen

Häufige Anwendungen der Kraftspektroskopie sind Messungen von Polymer Elastizität, insbesondere Biopolymere wie RNA und DNA.[15] Andere Biophysisch Die Anwendung der Polymerkraftspektroskopie ist eingelegt Protein Entfaltung.[16] Modulare Proteine ​​können an a adsorbiert werden Gold oder (seltener) Glimmer auftauchen und dann gestreckt. Die sequentielle Entfaltung von Modulen wird als sehr charakteristisches Sägezahnmuster der Kraft gegen Delongationsdiagramm beobachtet. Jeder Zahn entspricht der Entfaltung eines einzelnen Proteinmoduls (abgesehen von der letzten ist dies im Allgemeinen die Ablösung des Proteinmoleküls von der Spitze). Viele Informationen über die Proteinelastizität und die Proteinentwicklung können durch diese Technik erhalten werden. Viele Proteine ​​in den Lebenden Zelle muss mechanischer Stress ausgesetzt sein.

Darüber hinaus kann die Kraftspektroskopie verwendet werden, um die enzymatische Aktivität von Proteinen zu untersuchen DNA Replikation, Transkription, Organisation und Reparatur. Dies wird erreicht, indem die Position einer an einem DNA-Protein-Komplex befestigten Perlen an einem DNA-Tether mit einem Ende an einer Oberfläche gebunden ist, während die Kraft konstant bleibt. Diese Technik wurde beispielsweise zur Untersuchung der Hemmung der Transkriptionsverlängerung durch Klebsidin und Acinetodin verwendet.[17]

Die andere Hauptanwendung der Kraftspektroskopie ist die Untersuchung von mechanischer Widerstand von chemischen Bindungen. In diesem Fall wird die Spitze im Allgemeinen mit einem Liganden funktionalisiert, der an ein anderes Molekül bindet, das an die Oberfläche gebunden ist. Die Spitze wird auf die Oberfläche gedrückt, wodurch der Kontakt zwischen den beiden Molekülen ermöglicht und dann zurückgezogen wird, bis die neu gebildete Bindung aufbricht. Die Kraft, bei der die Bindung aufbricht, wird gemessen. Da ist mechanisches Brechen ein kinetischer, stochastischer ProzessDie Bruchkraft ist kein absoluter Parameter, sondern eine Funktion sowohl der Temperatur als auch der Zuggeschwindigkeit. Niedrige Temperaturen und hohe Ziehgeschwindigkeiten entsprechen höheren Bruchkräften. Durch sorgfältige Analyse der Bruchkraft bei verschiedenen Ziehgeschwindigkeiten ist es möglich, die abzubilden Energie Landschaft der chemischen Bindung unter mechanischer Kraft.[18] Dies führt zu interessanten Ergebnissen in der Studie von Antikörper-AntigenProtein-Protein, Protein lebende Zellinteraktion und Bindungen fangen.[19]

In letzter Zeit wurde diese Technik in verwendet Zellen-Biologie die aggregativen Messung stochastisch Kräfte geschaffen von Motorproteine Dies beeinflusst die Bewegung von Partikeln im Zytoplasma. In dieser Art kann die Kraftspektrum -Mikroskopie besser verwendet werden, um die vielen zellulären Prozesse zu verstehen, die die Bewegung von Partikeln innerhalb von Zytoplasma erfordern.[20]

Verweise

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Literaturverzeichnis