Fluoreszenzspektroskopie

Atom -Fluoreszenzspektroskopieanalysator zur Bestimmung von Merkur

Fluoreszenzspektroskopie (auch bekannt als Fluorimetrie oder Spektrofluorometrie) ist eine Art von Art von elektromagnetische Spektroskopie das analysiert Fluoreszenz aus einer Probe. Es geht normalerweise darum, einen Lichtstrahl zu verwenden, normalerweise ultraviolettes Licht, das erregt die Elektronen in Moleküle von bestimmten Verbindungen und veranlasst sie, Licht auszugeben; Typischerweise, aber nicht unbedingt, sichtbares Licht. Eine ergänzende Technik ist Absorptionsspektroskopie. Im Sonderfall einer Einzelmolekül -Fluoreszenzspektroskopie werden Intensitätsschwankungen aus dem emittierten Licht entweder aus einzelnen Fluorophoren oder aus Fluorophorepaaren gemessen.

Geräte, die die Fluoreszenz messen, werden genannt Fluorometer.

Theorie

Hauptartikel: Fluoreszenz

Moleküle haben verschiedene Zustände als als bezeichnet Energieniveaus. Die Fluoreszenzspektroskopie befasst sich hauptsächlich mit elektronischen und Schwingungszuständen. Im Allgemeinen hat die untersuchte Art a gemahlener elektronischer Zustand (Ein niedriger Energiezustand) von Interesse und ein angeregter elektronischer Zustand höherer Energie. In jedem dieser elektronischen Zustände gibt es verschiedene Schwingungszustände.[1]

In der Fluoreszenz wird die Spezies zuerst angeregt, indem a absorbiert werden Photonvon seinem Boden elektronischer Zustand bis zu einem der verschiedenen Schwingungszustände im angeregten elektronischen Zustand. Kollisionen mit anderen Molekülen verursachen das angeregte Molekül, bis es Schwingungsenergie verliert, bis es den niedrigsten Schwingungszustand aus dem angeregten elektronischen Zustand erreicht. Dieser Prozess wird oft mit a visualisiert Jablonski Diagramm.[1]

Das Molekül fällt dann wieder auf einen der verschiedenen Schwingungsniveaus des elektronischen Zustands des Bodens und emittiert dabei ein Photon.[1] Da Moleküle in mehreren Schwingungsniveaus im Grundzustand fallen können, haben die emittierten Photonen unterschiedliche Energien und damit Frequenzen. Daher kann durch Analyse der unterschiedlichen Lichtfrequenzen des in fluoreszierenden Spektroskopie zusammen mit ihren relativen Intensitäten emittierten Struktur der verschiedenen Schwingungsniveaus bestimmt werden.

Für Atomarten ist der Prozess ähnlich; Da Atomspezies jedoch keine Schwingungsenergiespiegel aufweisen, sind die emittierten Photonen häufig bei der gleichen Wellenlänge wie die einfallende Strahlung. Dieser Prozess der Wiedereinstellung des absorbierten Photons ist "Resonanzfluoreszenz" und ist zwar für die atomare Fluoreszenz charakteristisch, ist jedoch auch in molekularer Fluoreszenz zu beobachten.[2]

In einer typischen Fluoreszenzmessung (Emission) wird die Anregungswellenlänge fixiert und die Nachweiswellenlänge variiert, während in einer Fluoreszenzanregungsmessung die Nachweiswellenlänge festgelegt und die Anregungswellenlänge über einen interessierenden Bereich variiert wird. Ein Emissionskarte wird durch Aufzeichnung der Emissionsspektren gemessen, die sich aus einem Bereich von Anregungswellenlängen ergeben und sie alle zusammen kombinieren. Dies ist ein dreidimensionaler Oberflächendatensatz: Emissionsintensität als Funktion der Anregungs- und Emissionswellenlängen und wird typischerweise als Konturkarte dargestellt.

Instrumentierung

Es gibt zwei allgemeine Arten von Instrumenten: Filterfluorometer das verwenden Filter, um das einfallende Licht zu isolieren und fluoreszierend Licht und Spektrofluorometer das benutzt a Beugungsgitter Monochromatoren das einfallende Licht und fluoreszierendes Licht zu isolieren.

Beide Typen verwenden das folgende Schema: Das Licht einer Anregungsquelle führt durch einen Filter oder einen Monochromator und schlägt die Probe. Ein Anteil des einfallenden Lichts wird von der Probe und einige der Moleküle in der Probenfluoreszation absorbiert. Das fluoreszierende Licht wird in alle Richtungen emittiert. Einige dieser fluoreszierenden Lichts durchlaufen einen zweiten Filter oder einen Monochromator und erreicht einen Detektor, der normalerweise bei 90 ° zum einfallenden Lichtstrahl platziert ist, um das Risiko eines übertragenen oder reflektierten einfallenden Lichts zu minimieren, das den Detektor erreicht.

Ein vereinfachtes Design der Komponenten eines Fluorimeters

Verschiedene Lichtquellen können als Anregungsquellen verwendet werden, einschließlich Lasern, LED und Lampen. Xenon -Bögen und Quecksilber-Dampf-Lampen im Speziellen. Ein Laser emittiert nur das Licht einer hohen Bestrahlungsanstrengung in einem sehr engen Wellenlängenintervall, typischerweise unter 0,01 nm, was einen Anregungsmonochromator oder einen Filter unnötig macht. Der Nachteil dieser Methode ist, dass die Wellenlänge eines Lasers nicht viel verändert werden kann. Eine Quecksilberdampflampe ist eine Linienlampe, was bedeutet, dass sie leichte in der Nähe von Spitzenwellenlängen emittiert. Im Gegensatz dazu hat ein Xenon-Bogen ein kontinuierliches Emissionsspektrum mit nahezu konstanter Intensität im Bereich von 300 bis 800 nm und eine ausreichende Bestrahlungsstärke für Messungen auf knapp über 200 nm.

Filter und/oder Monochromatoren können in Fluorimetern verwendet werden. Ein Monochromator überträgt das Licht einer einstellbaren Wellenlänge mit einer einstellbaren Toleranz. Die häufigste Art von Monochromator verwendet ein Beugungsgitter, das heißt, kollimiert Licht beleuchtet ein Gitter und verläuft je nach Wellenlänge mit einem anderen Winkel. Der Monochromator kann dann eingestellt werden, um auszuwählen, welche Wellenlängen zu übertragen werden sollen. Für die Erlaubnis von Anisotropiemessungen ist die Zugabe von zwei Polarisationsfiltern erforderlich: eine nach dem Anregungsmonochromator oder -filter und eines vor dem Emissionsmonochromator oder -filter.

Wie bereits erwähnt, wird die Fluoreszenz am häufigsten in einem Winkel von 90 ° im Verhältnis zum Anregungslicht gemessen. Diese Geometrie wird verwendet, anstatt den Sensor an der Linie des Anregungslichts in einem Winkel von 180 ° zu platzieren, um eine Störung des übertragenen Anregungslichts zu vermeiden. Kein Monochromator ist perfekt und wird einige übertragen Streulichtdas heißt, Licht mit anderen Wellenlängen als die gezielten. Ein idealer Monochromator würde nur Licht im angegebenen Bereich übertragen und eine wellenlängenunabhängige Übertragung aufweisen. Bei der Messung in einem Winkel von 90 ° verursacht nur das von der Probe verstreute Licht ein streunendes Licht. Dies führt zu einem besseren Signal-Rausch-Verhältnis und senkt die Erkennungsgrenze um ungefähr einen Faktor 10000.[3] im Vergleich zur 180 ° -Geometrie. Darüber hinaus kann die Fluoreszenz auch von vorne gemessen werden, was häufig für turbische oder undurchsichtige Proben durchgeführt wird.[4]

Der Detektor kann entweder einkanal oder mehrkanal sein. Der Einzelkanaldetektor kann jeweils nur die Intensität einer Wellenlänge erkennen, während die Mehrkanal-Intensität alle Wellenlängen gleichzeitig erkennt, wodurch der Emissionsmonochromator oder der Filter unnötig wird. Die verschiedenen Arten von Detektoren haben sowohl Vor- als auch Nachteile.

Die vielseitigsten Fluorimeter mit zwei Monochromatoren und einer kontinuierlichen Anregungslichtquelle können sowohl ein Anregungsspektrum als auch ein Fluoreszenzspektrum aufzeichnen. Bei der Messung der Fluoreszenzspektren wird die Wellenlänge des Anregungslichts konstant gehalten, vorzugsweise bei einer Wellenlänge mit hoher Absorption, und der Emissionsmonochromator scannt das Spektrum. Zur Messung von Anregungsspektren wird die Wellenlänge, die durch den Emissionsfilter oder den Monochromator verläuft, konstant gehalten und der Anregungsmonochromator scannt. Das Anregungsspektrum ist im Allgemeinen identisch mit dem Absorptionsspektrum, da die Fluoreszenzintensität proportional zur Absorption ist.[5]

Datenanalyse

Gnu r Export von OpenChrom
OpenFluor -Plugin in OpenChrom Substanzübereinstimmungen zeigen[6]

Bei niedrigen Konzentrationen die Fluoreszenz Intensität wird im Allgemeinen proportional zur Konzentration des Fluorophor.

Im Gegensatz zu UV/sichtbarer Spektroskopie können unabhängige Gerätespektren nicht leicht erreicht werden. Mehrere Faktoren beeinflussen und verzerren die Spektren, und Korrekturen sind notwendig, um „wahr“ zu erreichen, d. H. Maschinenunabhängig, Spektren. Die verschiedenen Arten von Verzerrungen werden hier entweder als instrumentell oder als Stichprobe eingestuft. Erstens wird die Verzerrung des Instruments diskutiert. Zu Beginn variieren die Lichtquellenintensität und die Wellenlängeneigenschaften im Laufe der Zeit während jedes Experiments und zwischen jedem Experiment. Darüber hinaus hat keine Lampe bei allen Wellenlängen eine konstante Intensität. Um dies zu korrigieren, kann nach dem Anregungsmonochromator oder Filter ein Strahlsplitter angewendet werden, um einen Teil des Lichts an einen Referenzdetektor zu lenken.

Darüber hinaus muss die Übertragungseffizienz von Monochromatoren und Filtern berücksichtigt werden. Diese können sich auch im Laufe der Zeit ändern. Die Übertragungseffizienz des Monochromators variiert auch je nach Wellenlänge. Dies ist der Grund, warum ein optionaler Referenzdetektor nach dem Anregungsmonochromator oder Filter platziert werden sollte. Der Prozentsatz der vom Detektor aufgenommenen Fluoreszenz hängt ebenfalls vom System ab. Darüber hinaus variiert der Detektorquanteneffizienz, dh der Prozentsatz der nachgewiesenen Photonen, zwischen verschiedenen Detektoren mit Wellenlänge und Zeit, da sich der Detektor unweigerlich verschlechtert.

Zwei weitere Themen, die berücksichtigt werden müssen, umfassen die Optik, mit der die Strahlung geleitet wird, und die Mittel zum Halten oder Enthaltenden des Probenmaterials (genannt als Kuvette oder Zelle). Für die meisten UV-, sichtbaren und NIR -Messungen ist die Verwendung von Präzisionsquarzkuvetten erforderlich. In beiden Fällen ist es wichtig, Materialien auszuwählen, die relativ geringe Absorption im Wellenlängenbereich haben. Quarz ist ideal, weil es von 200 nm-2500 nm überträgt. höherer Quarz kann sogar bis zu 3500 nm übertragen, während die Absorptionseigenschaften anderer Materialien die Fluoreszenz aus der Probe maskieren können.

Die Korrektur all dieser instrumentellen Faktoren für das Erhalten eines Standardspektrums ist ein mühsamer Prozess, der nur in der Praxis angewendet wird, wenn es unbedingt erforderlich ist. Dies ist der Fall bei der Messung der Quantenausbeute oder beim Finden der Wellenlänge mit der höchsten Emissionsintensität beispielsweise.

Wie bereits erwähnt, entstehen auch Verzerrungen aus der Stichprobe. Daher müssen auch einige Aspekte der Stichprobe berücksichtigt werden. Erstens kann die Fotodetrie die Intensität der Fluoreszenz im Laufe der Zeit verringern. Die Lichtstreuung muss ebenfalls berücksichtigt werden. Die wichtigsten Arten der Streuung in diesem Zusammenhang sind Rayleigh und Raman -Streuung. Licht verstreut von Rayleigh Streuung hat die gleiche Wellenlänge wie das einfallende Licht, während in Raman -Streuung Das verstreute Licht ändert die Wellenlänge normalerweise zu längeren Wellenlängen. Die Raman -Streuung ist das Ergebnis eines virtuellen elektronischen Zustands, der durch das Anregungslicht induziert wird. Davon Virtueller ZustandDie Moleküle können sich zu einem anderen Schwingungsniveau als dem Schwingungsgrundzustand entspannen.[7] In Fluoreszenzspektren wird es immer bei einer konstanten Wellenzahldifferenz in Bezug auf die Anregungswellenzahl, z. Der Peak erscheint bei einer Wellenzahl 3600 cm–1 niedriger als das Anregungslicht im Wasser.

Weitere Aspekte, die berücksichtigt werden müssen, sind die inneren Filtereffekte.[8][9] Dazu gehören die Reabsorption. Die Reabsorption tritt auf, weil ein anderes Molekül oder ein Teil eines Makromoleküls an den Wellenlängen absorbiert, bei denen das Fluorophor Strahlung emittiert. Wenn dies der Fall ist, können einige oder alle vom Fluorophor emittierten Photonen erneut absorbiert werden. Ein weiterer innerer Filtereffekt tritt aufgrund hoher Konzentrationen von absorbierenden Molekülen, einschließlich des Fluorophors, auf. Das Ergebnis ist, dass die Intensität des Anregungslichts während der gesamten Lösung nicht konstant ist. Es ist daraus, dass nur ein kleiner Prozentsatz des Anregungslichts die Fluorophore erreicht, die für das Erkennungssystem sichtbar sind. Die inneren Filtereffekte verändern das Spektrum und die Intensität des emittierten Lichts und müssen daher bei der Analyse des Emissionsspektrums von Fluoreszenzlicht berücksichtigt werden.[5][10]

Tryptophan -Fluoreszenz

Das Fluoreszenz von a gefaltetes Protein ist eine Mischung der Fluoreszenz aus einzelnen aromatischen Rückständen. Die meisten intrinsischen Fluoreszenzemissionen eines gefalteten Proteins sind auf die Anregung von zurückzuführen Tryptophan Reste mit einigen Emissionen aufgrund von Tyrosin und Phenylalanin; Disulfidbindungen haben aber auch eine nennenswerte Absorption in diesem Wellenlängenbereich. Typischerweise hat Tryptophan eine Wellenlänge der maximalen Absorption von 280 nm und einen Emissionspeak, der ist Solvatochrom, reicht von ca. 300 bis 350 nm abhängig von der Polarität der lokalen Umgebung [11] Daher kann die Proteinfluoreszenz als Diagnose des Konformationszustands eines Proteins verwendet werden.[12] Darüber hinaus wird die Tryptophan -Fluoreszenz stark von der Nähe anderer Reste beeinflusst (d.h., in der Nähe protoniert Gruppen wie ASP oder GLU können verursachen Quenching von TRP -Fluoreszenz). Außerdem ist der Energieübertragung zwischen Tryptophan und den anderen fluoreszierenden Aminosäuren möglich, was die Analyse beeinflussen würde, insbesondere in Fällen, in denen der saure Förster -Ansatz gewählt wird. Darüber hinaus ist Tryptophan eine relativ seltene Aminosäure; Viele Proteine ​​enthalten nur einen oder einige Tryptophanreste. Daher kann Tryptophan -Fluoreszenz eine sehr empfindliche Messung des Konformationszustands einzelner Tryptophanreste sein. Der Vorteil im Vergleich zu extrinsischen Sonden ist, dass das Protein selbst nicht verändert wird. Die Verwendung der intrinsischen Fluoreszenz für die Untersuchung der Proteinkonformation ist in der Praxis auf Fälle mit wenigen (oder vielleicht nur nur einem) Tryptophanresten beschränkt, da jeweils eine andere lokale Umgebung erlebt, was zu unterschiedlichen Emissionsspektren führt.

Tryptophan ist eine wichtige intrinsische Fluoreszenz (Aminosäure), mit der die Art der Mikroumgebung des Tryptophans abgeschrieben werden kann. Bei der Durchführung von Experimenten mit Denaturanten, Tenside oder andere Amphiphil Moleküle, die Mikroumgebung des Tryptophans könnte sich ändern. Wenn beispielsweise ein Protein, das ein einzelnes Tryptophan in seinem „hydrophoben“ Kern enthält, mit zunehmender Temperatur denaturiert wird, wird ein rotverschobenes Emissionsspektrum auftreten. Dies ist auf die Exposition des Tryptophans in eine wässrige Umgebung im Gegensatz zu einem hydrophoben Proteininterieur zurückzuführen. Im Gegensatz dazu führt die Zugabe eines Tensids zu einem Protein, das ein Tryptophan enthält, das dem wässrigen Lösungsmittel ausgesetzt ist Vesikel oder Micelle.[13] Proteine, denen Tryptophan mangelt Fluorophor.

Mit der Fluoreszenzanregung bei 295 nm dominiert das Tryptophan -Emissionsspektrum über das Schwächere Tyrosin und Phenylalanin Fluoreszenz.

Anwendungen

Fluoreszenzspektroskopie wird unter anderem in biochemischen, medizinischen und chemischen Forschungsfeldern zur Analyse verwendet organische Verbindungen. Es gab auch einen Bericht über die Verwendung bei der Differenzierung bösartiger Hauttumoren von gutartigen.

Atomic Fluoreszenzspektroskopie (AFS) -Techniken sind bei anderen Arten der Analyse/Messung einer Verbindung in Luft oder Wasser oder anderen Medien wie z. B. nützlich Cvafs die zur Erkennung von Schwermetallen wie Quecksilber verwendet wird.

Fluoreszenz kann auch verwendet werden, um Photonen umzuleiten, siehe fluoreszierendes Solarsammler.

Zusätzlich kann die Fluoreszenzspektroskopie mit dem mikroskopischen Niveau unter Verwendung Mikrofluorimetrie

In der analytischen Chemie werden Fluoreszenzdetektoren verwendet mit HPLC.

Im Bereich der Wasserforschung kann die Fluoreszenzspektroskopie verwendet werden, um die Wasserqualität durch Erfassen organischer Schadstoffe zu überwachen.[14] Jüngste Fortschritte in Informatik und maschinellem Lernen haben sogar die Erkennung von Wasserverschmutzung von Wasser ermöglicht [15]

Siehe auch

Verweise

  1. ^ a b c Animation für das Prinzip der Fluoreszenz und der UV-sichtbaren Absorption
  2. ^ Prinzipien der instrumentellen Analyse F.James Holler, Douglas A. Skoog & Stanley R. Crouch 2006
  3. ^ Rendell, D. (1987). Fluoreszenz und Phosphoreszenz. Krone
  4. ^ Eisinger, Josef; Flores, Jorge (1979). "Fluorometrie vorneflüssiger Proben". Analytische Biochemie. 94 (1): 15–21. doi:10.1016/0003-2697 (79) 90783-8. ISSN 0003-2697. PMID 464277.
  5. ^ a b Ashutosh Sharma; Stephen G. Schulman (21. Mai 1999). Einführung in die Fluoreszenzspektroskopie. Wiley. ISBN 978-0-471-11098-9.
  6. ^ Murphy, Kathleen R.; Stedmon, Colin A.; Wenig, Philip; Bro, Rasmus (2014). "OpenFluor-Eine Online-Spektralbibliothek mit Autofluoreszenz durch organische Verbindungen in der Umwelt" (PDF). Anal. Methoden. 6 (3): 658–661. doi:10.1039/c3ay41935e.
  7. ^ G. G. G. und Vo-Dinh, T. (2003). Handbuch der Spektroskopie. Wiley-vch.
  8. ^ Kimball, Joseph; Chavez, Jose; Ceresa, Luca; Kitchner, Emma; NureKeyev, Zhangatay; Doan, hängen; Szabelski, Mariusz; Borejdo, Julian; Gryczynski, Ignacy; Gryczynski, Zygmunt (2020-06-01). "Über den Ursprung und die Korrektur für innere Filtereffekte in Fluoreszenz Teil I: Primärer innerer Filtereffekt-der richtige Ansatz für die Korrektur der Probenabsorption". Methoden und Anwendungen in der Fluoreszenz. 8 (3): 033002. doi:10.1088/2050-6120/ab947c. ISSN 2050-6120.
  9. ^ Ceresa, Luca; Kimball, Joseph; Chavez, Jose; Kitchner, Emma; NureKeyev, Zhangatay; Doan, hängen; Borejdo, Julian; Gryczynski, Ignacy; Gryczynski, Zygmunt (2021-05-24). "Über den Ursprung und die Korrektur für innere Filtereffekte in der Fluoreszenz. Teil II: Sekundärer innerer Filtereffekt -Die ordnungsgemäße Verwendung der Konfiguration vornegesichts für hochabsorbierende und streuende Proben". Methoden und Anwendungen in der Fluoreszenz. 9 (3): 035005. doi:10.1088/2050-6120/AC0243. ISSN 2050-6120.
  10. ^ Lakowicz, J. R. (1999). Prinzipien der Fluoreszenzspektroskopie. Kluwer Academic / Plenum Publishers
  11. ^ Intrinsische Fluoreszenz von Proteinen und Peptiden Archiviert 2010-05-16 bei der Wayback -Maschine
  12. ^ Vivian JT, Callis PR (2001). "Mechanismen der Tryptophan -Fluoreszenzverschiebungen in Proteinen". Biophys. J. 80 (5): 2093–109. Bibcode:2001bpj .... 80.2093v. doi:10.1016/S0006-3495 (01) 76183-8. PMC 1301402. PMID 11325713. Archiviert von das Original am 6. September 2008.
  13. ^ Caputo GA, London E. Kumulative Wirkungen von Aminosäure-Substitutionen und hydrophobe Fehlanpassung auf die Transmembranstabilität und Konformation von hydrophoben Alpha-Helices. Biochemie. 2003 März 25; 42 (11): 3275-85.
  14. ^ Carstea, Elfrida M.; Bridgeman, John; Baker, Andy; Reynolds, Darren M. (2016-05-15). "Fluoreszenzspektroskopie für die Abwasserüberwachung: Eine Überprüfung". Wasserforschung. 95: 205–219. doi:10.1016/j.watres.2016.03.021. ISSN 0043-1354. PMID 26999254.
  15. ^ Nakar, Amir; Schmilovitch, Ze'ev; Vaizel-Hayon, Dalit; Kroupitski, Yulia; Borisover, Mikhail; SELA (SINDERGER), SHLOMO (2020-02-01). "Quantifizierung von Bakterien im Wasser unter Verwendung der PLS-Analyse der Emissionsspektren von Fluoreszenz- und Anregungsemissionsmatrizen". Wasserforschung. 169: 115197. doi:10.1016/j.watres.2019.115197. ISSN 0043-1354. PMID 31670087.

Externe Links