DNA Replikation

DNA -Replikation: die Doppelhelix ist un'zipped 'und wound, dann wird jeder getrennte Strang (türkis) als Vorlage für die Replikation eines neuen Partners Strand (grün) wirkt. Nukleotide (Basen) werden mit der Synthese der neuen Partnerstränge in zwei neue Doppelhelices übereinstimmen.

Im Molekularbiologie, DNA Replikation ist der Biologischer Prozess zwei identische Repliken von DNA aus einem Original zu produzieren DNA Molekül.[1] DNA -Replikation tritt in allen auf lebende Organismen als das wichtigste Teil für Biologischer Vererbung. Dies ist für die Zellteilung während des Wachstums und der Reparatur beschädigter Gewebe von wesentlicher Bedeutung, während sie auch sicherstellt, dass jede der neuen Zellen eine eigene Kopie der DNA erhält.[2] Die Zelle besitzt die charakteristische Eigenschaft der Teilung, die die Replikation der DNA wesentlich macht.

DNA besteht aus a Doppelhelix von zwei komplementär Stränge. Die Doppelhelix beschreibt das Erscheinungsbild einer doppelsträngigen DNA, die somit aus zwei linearen Strängen besteht, die sich gegenseitig entgegensetzen und sich zusammen verdrehen, um sich zu formen.[3] Während der Replikation sind diese Stränge getrennt. Jeder Strang des ursprünglichen DNA -Moleküls dient dann als Vorlage für die Herstellung seines Gegenstücks, ein Prozess, der als als bezeichnet wird Semikonservative Replikation. Infolge der semi-konservativen Replikation wird die neue Helix aus einem ursprünglichen DNA-Strang sowie einem neu synthetisierten Strang bestehen.[4] Zellulär Korrekturlesen und Fehlerprüfungsmechanismen sorgen für nahezu perfekt Treue Für die DNA -Replikation.[5][6]

In einem Zelle, DNA -Replikation beginnt an bestimmten Stellen oder Ursprünge der Replikation, in dem Genom[7] das enthält das genetische Material eines Organismus.[8] Entspannung der DNA am Ursprung und der Synthese neuer Stränge, untergebracht von einem Enzym bekannt als Helikase, führt in Replikationsgabeln bidirektional aus dem Ursprung wachsen. Eine Anzahl von Proteine sind mit der Replikationsgabel verbunden, um bei der Einleitung und Fortsetzung von zu helfen DNA -Synthese. Am wichtigsten, DNA -Polymerase synthetisiert die neuen Stränge durch Hinzufügen Nukleotide Das ergänzt jeden Strang (Vorlage). DNA-Replikation tritt während der S-Stufe von auf Interphase.

DNA -Replikation (DNA -Amplifikation) kann ebenfalls durchgeführt werden in vitro (künstlich außerhalb einer Zelle). DNA -Polymerasen, die aus Zellen und künstlichen DNA -Primern isoliert wurden, können verwendet werden, um die DNA -Synthese in bekannten Sequenzen in einem Template -DNA -Molekül zu starten. Polymerase Kettenreaktion (PCR), Ligase -Kettenreaktion (Lcr) und Transkriptionsvermittelte Amplifikation (TMA) sind Beispiele. Im März 2021 berichteten die Forscher Beweise, die darauf hindeuten, dass eine vorläufige Form von RNA übertragen, eine notwendige Komponente von Übersetzung, die biologische Synthese neuer Proteine gemäß dem genetischer Codehätte ein Replikatormolekül selbst in der sehr frühen Entwicklung des Lebens sein oder Abiogenese.[9][10]

DNA -Struktur

Die DNA existiert als doppelstrangierte Struktur, wobei beide Stränge zusammengefasst sind, um das Merkmal zu bilden Doppelhelix. Jeder einzelne DNA -Strang ist eine Kette von vier Arten von Nukleotide. Nukleotide in DNA enthalten a Desoxyribose Zucker, a Phosphat, und ein Nucleobase. Die vier Arten von Nukleotid entsprechen den vier Nucleobasen Adenin, Zytosin, Guanine, und Thymin, häufig als A, C, G und T. Adenine und Guanine abgekürzt Purine Basen, während Cytosin und Thymin sind Pyrimidine. Diese Nukleotide bilden sich PhosphodiesterbindungenErzeugung des Phosphat-Desoxyribose-Rückgrats der DNA-Doppelhelix mit den Nucleobasen, die nach innen zeigen (d. H. In Richtung des gegnerischen Strangs). Nucleobasen werden zwischen Strängen durcheinander übertragen Wasserstoffbrücken Formen Basispaare. Adeninpaare mit Thymin (zwei Wasserstoffbrückenbindungen) und Guaninpaare mit Cytosin (drei Wasserstoffbrücken).

DNA -Stränge haben eine Direktionalitätund die verschiedenen Enden eines einzelnen Strangs werden als "3 '(Drei-Prime) -Dende" und "5' (Fünf-Prime)-Ende" bezeichnet. Durch Konvention ist das linke Ende der Sequenz das 5' -Ende, wenn die Basissequenz eines einzelnen DNA -Strangs angegeben ist, während das rechte Ende der Sequenz das 3' -Ende ist. Die Stränge der Doppelhelix sind gegen Parallel mit 5 'bis 3' und der gegenüberliegenden Strang 3 'bis 5'. Diese Begriffe beziehen sich auf das Kohlenstoffatom in Desoxyribose, an das sich das nächste Phosphat in der Kette befindet. Die Direktionalität hat Konsequenzen in der DNA -Synthese, da die DNA -Polymerase DNA nur in einer Richtung synthetisieren kann, indem Nukleotide zum 3' -Ende eines DNA -Strangs hinzugefügt werden.

Die Paarung von Komplementärbasen in DNA (durch Wasserstoffbindung) bedeutet, dass die in jedem Strang enthaltenen Informationen überflüssig sind. Phosphodiestere (Intra-Strang) -Bindungen sind stärker als Wasserstoffbindungen (Zwischenstrang). Die tatsächliche Aufgabe der Phosphodiesterbindungen besteht darin Achse 1.[11] Dadurch können die Stränge voneinander getrennt werden. Die Nukleotide eines einzelnen Strangs können daher verwendet werden, um Nukleotide auf einem neu synthetisierten Partnerstrang zu rekonstruieren.[12]

DNA -Polymerase

Hauptartikel: DNA -Polymerase
DNA -Polymerasen fügt dem 3' -Ende eines DNA -Strangs Nukleotide hinzu.[13] Wenn eine Fehlanpassung versehentlich integriert ist, wird die Polymerase aus der weiteren Ausdehnung gehemmt. Das Korrekturlesen beseitigt das nicht übereinstimmende Nukleotid und die Verlängerung wird fortgesetzt.

DNA -Polymerasen sind eine Familie von Enzyme Das führt alle Formen der DNA -Replikation aus.[14] DNA -Polymerasen können im Allgemeinen keine Synthese neuer Stränge initiieren, sondern können nur einen vorhandenen DNA- oder RNA -Strang mit einem Vorlagenstrang ausdehnen. Um mit der Synthese zu beginnen, ein kurzes RNA -Fragment, genannt a Grundierung, muss erstellt und mit dem Template -DNA -Strang kombiniert werden.

DNA -Polymerase fügt einen neuen DNA -Strang hinzu, indem das 3' Nukleotide übereinstimmend mit dem Vorlagenstrang nacheinander über die Erstellung von Phosphodiesterbindungen. Die Energie für diesen Prozess der DNA -Polymerisation beruht auf der Hydrolyse der Hochenergetischer Phosphat (Phosphoanhydrid) -Bindungen zwischen den drei an jedem nicht rechtsfähigen Phosphaten gebundenen Phosphaten Base. Freie Basen mit ihren angebrachten Phosphatgruppen werden genannt Nukleotide; Insbesondere Basen mit drei angeschlossenen Phosphatgruppen werden aufgerufen Nukleosidtriphosphate. Wenn einem wachsenden DNA-Strang ein Nukleotid zugesetzt wird Pyrophosphat. Enzymatische Hydrolyse des resultierenden Pyrophosphat In anorganisches Phosphat verbraucht Phosphat eine zweite hohe Energienphosphatbindung und macht die Reaktion effektiv irreversibel.[Anmerkung 1]

Im Allgemeinen sind DNA -Polymerasen sehr genau, mit einer intrinsischen Fehlerrate von weniger als einem Fehler pro 107 Nukleotide hinzugefügt.[15] Darüber hinaus haben einige DNA -Polymerasen auch Korrekturlesen. Sie können Nukleotide vom Ende eines wachsenden Strangs entfernen, um nicht übereinstimmende Basen zu korrigieren. Schließlich überwachen die Reparaturmechanismen nach der Replikation die DNA auf Fehler und sind in der Lage, Fehlanpassungen im neu synthetisierten DNA-Strang von der ursprünglichen Strangsequenz zu unterscheiden. Zusammen ermöglichen diese drei Diskriminierungsschritte die Replikationstreue von weniger als einem Fehler pro 109 Nukleotide hinzugefügt.[15]

Die Rate der DNA-Replikation in einer lebenden Zelle wurde zuerst als die Rate der Phagen-T4-DNA-Dehnung in Phagen-infiziert gemessen E coli.[16] Während der Zeit des exponentiellen DNA -Anstiegs bei 37 ° C betrug die Geschwindigkeit 749 Nukleotide pro Sekunde. Die Mutationsrate pro Basenpaar pro Replikation während der Phagen -T4 -DNA -Synthese beträgt 1,7 pro 108.[17]

Replikationsprozess

Hauptartikel: Prokaryotische DNA -Replikation und Eukaryotische DNA -Replikation
Überblick über die Schritte in der DNA -Replikation
Schritte in der DNA -Synthese

Die DNA -Replikation erfolgt wie alle biologischen Polymerisationsprozesse in drei enzymatisch katalysierten und koordinierten Schritten: Initiierung, Verlängerung und Beendigung.

Einleitung

Rolle von Initiatoren zur Einleitung der DNA -Replikation.
Bildung des Vorbereitungskomplexes.

Für ein Zelle zu teilen, es muss zuerst seine DNA replizieren.[18] Die DNA-Replikation ist ein All-or-None-Prozess; Sobald die Replikation beginnt, wird sie bis zur Fertigstellung fortgesetzt. Sobald die Replikation abgeschlossen ist, tritt sie im selben Zellzyklus nicht erneut auf. Dies wird durch die Aufteilung der Initiierung des Vorreplikationskomplex.

Vorreplikationskomplex

Hauptartikel: Vorreplikationskomplex

Zu spät Mitose und früh G1 -Phase, ein großer Komplex von Initiatorproteinen montiert an bestimmten Stellen in der DNA, die als "bekannt als" vor dem Replikationskomplex "Ursprünge".[7] Im E coli Das primäre Initiatorprotein ist DNAA; in Hefe, Dies ist das Ursprungserkennungskomplex.[19] Sequenzen, die von Initiatorproteinen verwendet werden, sind tendenziell "AT-reichen" (reich an Adenin- und Thyminbasen), da A-T-Basenpaare zwei Wasserstoffbrückenbindungen (anstatt die drei in einem C-G-Paar gebildeten) aufweisen und daher leichter zu trennend sind.[20] In Eukaryoten katalysiert der Ursprungserkennungskomplex den Zusammenbau von Initiatorproteinen in den Vorreplikationskomplex. Darüber hinaus legt ein aktueller Bericht nahe, dass angehende Hefe -Ork -ORC zellzyklusabhängig dimerisiert, um die Lizenzierung zu kontrollieren.[21][22] ORC und NOC3P sind während des gesamten Zellzyklus kontinuierlich an das Chromatin gebunden.[23] CDC6 und CDT1 assoziieren Sie dann den gebundenen Ursprungserkennungskomplex am Ursprung, um einen größeren Komplex zu bilden MCM -Komplex auf die DNA. Der MCM -Komplex ist die Helikase, die die DNA -Helix bei den Replikationsursprüngen entwirft und Replikationsgabeln in Eukaryoten. Der MCM-Komplex wird in der späten G1-Phase rekrutiert und durch den ORC-CDC6-CDT1-Komplex über die DNA über das ATP-abhängige Protein-Remodelling geladen. Die Belastung des MCM-Komplexes in die Ursprungs-DNA markiert die Fertigstellung der Bildung vor dem Replikationskomplex.[24]

Wenn die Umgebungsbedingungen in der späten G1 -Phase richtig sind, sind G1 und G1/S Cyclin-CDK Komplexe werden aktiviert, die die Expression von Genen stimulieren, die Komponenten der DNA -synthetischen Maschinerie codieren. Die G1/S-CDK-Aktivierung fördert auch die Expression und Aktivierung von S-CDK-Komplexen, was eine Rolle bei der Aktivierung der Replikationsursprünge in Abhängigkeit von Spezies und Zelltyp spielen kann. Die Kontrolle dieser CDKs variiert je nach Zelltyp und Entwicklungsstadium. Diese Verordnung wird am besten in verstanden angehende Hefe, wo die S Cyclin CLB5 und CLB6 sind in erster Linie für die DNA -Replikation verantwortlich.[25] CLB5,6-CDK1-Komplexe lösen direkt die Aktivierung der Replikationsursprünge aus und sind daher in der gesamten S-Phase erforderlich, um jeden Ursprung direkt zu aktivieren.[24]

Auf ähnliche Art und Weise, CDC7 wird auch durch benötigt durch S Phase Replikationsursprünge aktivieren. CDC7 ist während des gesamten Zellzyklus nicht aktiv und seine Aktivierung ist streng zeitlich festgelegt, um eine vorzeitige Initiierung der DNA -Replikation zu vermeiden. In der späten G1 steigt die CDC7 -Aktivität aufgrund der Assoziation mit der regulatorischen Untereinheit abrupt an DBF4, das Cdc7 direkt bindet und seine Proteinkinaseaktivität fördert. Es wurde festgestellt, dass CDC7 ein ratenlimitierender Regulator der Herkunftsaktivität ist. Zusammen arbeiten die G1/S-CDKs und/oder S-CDKs und CDC7 zusammen, um die Replikationsursprünge direkt zu aktivieren, was zur Initiierung der DNA-Synthese führt.[24]

Vorinitiationskomplex

In der frühen S-Phase führen die Aktivierung von S-CDK und CDC7 zum Zusammenbau des Vorinitiationskomplexes, eines massiven Proteinkomplexes, der am Ursprung gebildet wurde. Die Bildung des Vorinitiationskomplexes verdrängt Cdc6 und Cdt1 aus dem Ursprungsreplikationskomplex, inaktivieren und destenten den Vorreplikationskomplex. Das Laden des Vorinitiationskomplexes in den Ursprung aktiviert die MCM -Helikase, wodurch die DNA -Helix entspannt wird. Der Vorinitiationskomplex lädt auch Lasten α-Primase und andere DNA -Polymerasen auf der DNA.[24]

Nachdem die α-Primase die ersten Primer synthetisiert, interagieren die Primer-Template-Junctions mit dem Klemmlader, der die Schieberklemme auf die DNA lädt, um die DNA-Synthese zu beginnen. Die Komponenten des Vorinitiationskomplexes bleiben mit Replikationsgabeln verbunden, wenn sie aus dem Ursprung ausgehen.[24]

Verlängerung

Die DNA -Polymerase hat eine 5'–3' -Aktivität. Alle bekannten DNA -Replikationssysteme erfordern ein kostenloses 3 ' Hydroxyl Gruppe vor der Synthese kann eingeleitet werden (Hinweis: Die DNA -Vorlage wird in 3'- bis 5' -Richtung gelesen, während ein neuer Strang in der 5' -bis 3' -Richtung synthetisiert wird - dies ist häufig verwirrt). Vier verschiedene Mechanismen für die DNA -Synthese werden erkannt:

  1. Alle zellulären Lebensformen und viele DNA Viren, Phagen und Plasmide verwenden ein Primase um einen kurzen RNA -Primer mit einer freien 3' -OH -Gruppe zu synthetisieren, die anschließend durch eine DNA -Polymerase verlängert wird.
  2. Die Retroelemente (einschließlich Retroviren) Verwenden Sie eine Transfer -RNA, die die DNA -Replikation durch eine freie 3 'OH bereitstellt, die zur Verlängerung durch die verwendet wird umgekehrte Transkriptase.
  3. In dem Adenoviren und die φ29 Familie von BakteriophagenDie 3' -OH -Gruppe wird durch die Seitenkette einer Aminosäure des am Genoms befestigten Proteins (das terminale Protein) bereitgestellt, zu dem Nukleotide von der DNA -Polymerase zu einem neuen Strang zugesetzt werden.
  4. In den einzelnen gestrandeten DNA -Viren - eine Gruppe, die die enthält Circoviren, das Geminiviren, das Parvoviren und andere - und auch die vielen Phagen und Plasmide Die RCR -Endonuklease verwenden den RCR -Mechanismus (Rolling Circle Replication) und erzeugt einen Nick im Genomstrang (einzelne gestrandete Viren) oder eines der DNA -Stränge (Plasmide). Das 5' -Ende des geschnitzten Strangs wird auf a übertragen Tyrosin Rückstände an der Nuklease und der freien 3' -OH -Gruppe werden dann von der DNA -Polymerase verwendet, um den neuen Strang zu synthetisieren.

Das erste ist das bekannteste dieser Mechanismen und wird von den zellulären Organismen verwendet. In diesem Mechanismus, sobald die beiden Stränge getrennt sind, Primase Fügt RNA -Primern den Vorlagensträngen hinzu. Der führende Strang erhält einen RNA -Primer, während der verzögerte Strang mehrere erhält. Der führende Strang wird durch eine DNA -Polymerase mit hoher kontinuierlich vom Primer ausgedehnt Prozessivität, während der Verzögerungstrang von jeder Primerform diskontinuierlich ausgedehnt wird Okazaki -Fragmente. RNase Entfernt die Primer -RNA -Fragmente und eine DNA -Polymerase mit geringer Prozessivität, die sich von der replikativen Polymerase unterscheidet, um die Lücken zu füllen. Wenn dies abgeschlossen ist, finden Sie ein einzelner Nick auf dem führenden Strang und mehrere Kerben am verzögerten Strang. Ligase Arbeitet diese Kerben ein und vervollständigt so das neu replizierte DNA -Molekül.

Die in diesem Prozess verwendete Primase unterscheidet sich signifikant dazwischen Bakterien und Archaea/Eukaryoten. Bakterien verwenden eine Primase zur Dnag Protein -Superfamilie, die eine katalytische Domäne des Toprim -Faltentyps enthält.[26] Die Toprim -Falte enthält einen α/β -Kern mit vier konservierten Strängen in a Rossmann-ähnlich Topologie. Diese Struktur findet sich auch in den katalytischen Domänen von Topoisomerase IA, Topoisomerase II, Altfamilien-Nukleasen und DNA-Reparaturproteine ​​im Zusammenhang mit dem Rekordprotein.

Die von Archaea und Eukaryoten verwendete Primase enthält dagegen eine stark abgeleitete Version der RNA -Erkennungsmotiv (RRM). Diese Primase ähnelt strukturell vielen viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerasen, reversen Transkriptasen, zyklischen Nukleotid, die Cyclasen erzeugen, und DNA-Polymerasen der A/B/Y-Familien, die an der DNA-Replikation und -reparatur beteiligt sind. In der eukaryotischen Replikation bildet die Primase einen Komplex mit pol α.[27]

Mehrere DNA -Polymerasen übernehmen unterschiedliche Rollen im DNA -Replikationsprozess. Im E coli, DNA Pol III ist das Polymerase -Enzym, das hauptsächlich für die DNA -Replikation verantwortlich ist. Es montiert zu einem Replikationskomplex an der Replikationsgabel, der eine extrem hohe Prozessivität aufweist und für den gesamten Replikationszyklus intakt bleibt. Im Gegensatz, DNA pol i ist das Enzym für den Austausch von RNA -Primern durch DNA. DNA Pol I hat eine 5 'bis 3' Exonuklease Aktivität zusätzlich zu ihrer Polymeraseaktivität und nutzt ihre Exonuklease -Aktivität, um die RNA Nick -Übersetzung. Pol I ist viel weniger prozessiv als pol III, da seine primäre Funktion in der DNA -Replikation darin besteht, viele kurze DNA -Regionen und nicht einige sehr lange Regionen zu erzeugen.

Im EukaryotenDas Enzym mit niedriger Prozessivitätspol α hilft bei der Initiierung der Replikation, da es einen Komplex mit Primase bildet.[28] In Eukaryoten wird angenommen, dass die führende Strangsynthese durch Pol ε durchgeführt wird; Diese Ansicht wurde jedoch kürzlich in Frage gestellt, was auf eine Rolle für Pol δ hinweist.[29] Die Entfernung der Primer ist pol δ abgeschlossen[30] während die Reparatur der DNA während der Replikation durch pol ε abgeschlossen wird.

Während die DNA Replikationsgabel mit zwei Zinken. In Bakterien, die einen einzigen Ursprung der Replikation auf ihrem kreisförmigen Chromosom haben, erzeugt dieser Prozess ein "Theta -Struktur"(ähnlich dem griechischen Buchstaben theta: θ). Im Gegensatz dazu haben Eukaryoten längere lineare Chromosomen und leiten die Replikation bei mehreren Ursprüngen innerhalb dieser.[31]

Replikationsgabel

Schema der Replikationsgabel.
A: Vorlage, B: Leading Strand, C: Lagging Strand, D: Replikationsgabel, E: Primer, F: Okazaki -Fragmente
Viele Enzyme sind an der DNA -Replikationsgabel beteiligt.

Die Replikationsgabel ist eine Struktur, die sich während der DNA -Replikation innerhalb der langen helikalen DNA bildet. Es wird durch Helikasen erzeugt, die die Wasserstoffbrückenbindungen brechen, die die beiden DNA -Stränge in der Helix zusammenhalten. Die resultierende Struktur hat zwei Verzweigungen "Zinken", die jeweils aus einem einzelnen DNA -Strang bestehen. Diese beiden Stränge dienen als Vorlage für die führenden und verzögerten Stränge, die als DNA -Polymerase -Übereinstimmung komplementärer Nukleotide zu den Vorlagen erzeugt werden. Die Vorlagen können ordnungsgemäß als die führende Strangvorlage und die verzögerte Strangvorlage bezeichnet werden.

Die DNA wird durch DNA -Polymerase in 3'- bis 5' -Richtung gelesen, was bedeutet, dass der neue Strang in 5 'bis 3' Richtung synthetisiert wird. Da die führenden und verzögerten Strangvorlagen in der Replikationsgabel in entgegengesetzte Richtungen ausgerichtet sind, ist ein Hauptproblem die Erreichung der Synthese der neuen Abnutzungsstrang -DNA, deren Syntheserichtung der Richtung der wachsenden Replikationsgabel entgegengesetzt ist.

Führender Strang

Der führende Strang ist der Strang neuer DNA, der in die gleiche Richtung wie die wachsende Replikationsgabel synthetisiert wird. Diese Art von DNA -Replikation ist kontinuierlich.

Verzögerungsstrang

Der Verzögerungstrang ist der Strang neuer DNA, dessen Syntheserichtung der Richtung der wachsenden Replikationsgabel entgegengesetzt ist. Aufgrund seiner Ausrichtung ist die Replikation des verzögerten Strangs komplizierter als der des führenden Strangs. Infolgedessen wird die DNA -Polymerase auf diesem Strang "hinter dem anderen Strang hinterher".

Der Verzögerungstrang wird in kurzen, getrennten Segmenten synthetisiert. Auf dem verzögerten Strang Schablone, a Primase "liest" die Template -DNA und initiiert die Synthese eines kurzen Komplementars RNA Grundierung. Eine DNA Okazaki -Fragmente. Die RNA -Primer werden dann entfernt und durch DNA ersetzt, und die DNA -Fragmente werden durch DNA -Ligase.

Dynamik bei der Replikationsgabel

Die zusammengebaute menschliche DNA -Klemme a Trimer des Proteins PCNA.

In allen Fällen besteht die Helikase aus sechs Polypeptiden, die nur einen Strang der replizierten DNA wickeln. Die beiden Polymerasen sind an die Helikase Hximer gebunden. In Eukaryoten wickelt sich die Helikase um den führenden Strang und in Prokaryoten wickelt sie sich um den verzögerten Strang.[32]

Wenn Helikase die DNA an der Replikationsgabel abwickelt, wird die DNA vor uns gezwungen, sich zu drehen. Dieser Prozess führt zu einem Aufbau von Wendungen in der DNA vor uns.[33] Dieser Aufbau bildet einen Torsionswiderstand, der den Fortschritt der Replikationsgabel schließlich stoppen würde. Topoisomerasen sind Enzyme, die die DNA -Stränge vorübergehend brechen und die durch Abwickeln der beiden Stränge der DNA -Helix verursachten Spannung lindern. Topoisomerasen (einschließlich DNA -Gyrase) Erreichen Sie dies, indem Sie negativ addieren Supercoils zur DNA -Helix.[34]

Nackte einsträngige DNA neigt dazu, sich auf sich selbst zu falten, um sich selbst zu formen Sekundärstrukturen; Diese Strukturen können die Bewegung der DNA -Polymerase beeinträchtigen. Um dies zu verhindern, Einzelstrangbindungsproteine Binden Sie an die DNA, bis ein zweiter Strang synthetisiert wird, wodurch die Bildung der Sekundärstruktur verhindert wird.[35]

Die doppelsträngige DNA ist herumgewickelt Histone Diese spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Genexpression, sodass die replizierte DNA an den gleichen Orten wie die ursprüngliche DNA um Histone gewickelt werden muss. Um dies zu gewährleisten, Histon Chaperone zerlegen die Chromatin Bevor es repliziert wird und die Histone an der richtigen Stelle ersetzen. Einige Schritte in dieser Zusammensetzung sind etwas spekulativ.[36]

Klemmproteine Bilden Sie eine Gleitklemme um die DNA, wodurch die DNA -Polymerase in Kontakt mit ihrer Vorlage aufrechterhalten wird und damit die Prozessivität unterstützt wird. Das innere Gesicht der Klemme ermöglicht es DNA, durch sie eingefädelt zu werden. Sobald die Polymerase das Ende der Vorlage erreicht oder doppelsträngige DNA erkennt, erfährt die Gleitklemme eine Konformationsänderung, die die DNA-Polymerase freigibt. Klemmladungsproteine ​​werden verwendet, um die Klemme zunächst zu laden, wodurch die Verbindung zwischen Vorlagen- und RNA-Primern erfasst wird.[6]: 274-5

DNA -Replikationsproteine

Bei der Replikationsgabel werden viele Replikationsenzyme auf der DNA zu einer komplexen molekularen Maschine genannt Wiederholung. Das Folgende ist eine Liste der wichtigsten DNA -Replikationsenzyme, die am Repisom teilnehmen:[37]

Enzym Funktion in der DNA -Replikation
DNA -Helikase Auch als Helix destabilisierendes Enzym bekannt. Helikase trennt die beiden DNA -Stränge an der Replikationsgabel Hinter der Topoisomerase.
DNA -Polymerase Das Enzym, das für die Katalyse der Zugabe von Nucleotidsubstraten zu DNA in der 5'- bis 3' -Richtung während der DNA -Replikation verantwortlich ist. Führt auch Proof-Lesen- und Fehlerkorrektur durch. Es gibt viele verschiedene Arten von DNA -Polymerase, die jeweils unterschiedliche Funktionen in verschiedenen Zellenarten ausführen.
DNA -Klemme Ein Protein, das verhindert, dass dehnende DNA -Polymerasen vom DNA -Elternstrang dissoziieren.
Einzelstrang-DNA-bindendes Protein Binden Sie an ssDNA und verhindern Sie, dass die DNA-Doppelhelix nach dem Abspann von DNA-Helikase erneut angerichtet wird, wodurch die Strangabtrennung aufrechterhalten wird und die Synthese des neuen Strangs erleichtert wird.
Topoisomerase Entspannen Sie die DNA von ihrer supergekratzten Natur.
DNA -Gyrase Lindert den Stamm des Abwickelns durch DNA -Helikase; Dies ist eine bestimmte Art von Topoisomerase
DNA -Ligase Die halbkonservativen Stränge neu anniert und verbindet Okazaki -Fragmente des verzögerten Strangs.
Primase Bietet einen Ausgangspunkt der RNA (oder DNA) für DNA -Polymerase, um die Synthese des neuen DNA -Strangs zu beginnen.
Telomerase Verlängert die telomere DNA durch Hinzufügen repetitiver Nukleotidsequenzen zu den Enden von eukaryotische Chromosomen. Dies ermöglicht Keim- und Stammzellen, die zu vermeiden Hayflick -Grenze auf Zellteilung.[38]

Replikationsmaschinerie

E. coli Repisom. Bemerkenswerterweise bildet die DNA an verzögerter Strang eine Schleife. Die genaue Struktur der Repisom ist nicht gut verstanden.

Replikationsmaschinen bestehen aus Faktoren, die an der DNA -Replikation beteiligt sind und auf Template SSDNAs erscheinen. Replikationsmaschinen umfassen Primosotoren sind Replikationsenzyme; DNA -Polymerase, DNA -Helikasen, DNA -Klemmen und DNA -Topoisomerasen sowie Replikationsproteine; z.B. Einzelsträngige DNA-Bindungsproteine ​​(SSB). In den Replikationsmaschinen koordinieren diese Komponenten. In den meisten Bakterien befinden sich alle Faktoren, die an der DNA -Replikation beteiligt sind, auf Replikationsgabeln und die Komplexe bleiben während der DNA -Replikation auf den Gabeln. Diese Replikationsmaschinen werden genannt Wiederholungen oder DNA -Replikasesysteme. Diese Begriffe sind generische Begriffe für Proteine, die sich in Replikationsgabeln befinden. Bei eukaryotischen und einigen Bakterienzellen werden die Replisomen nicht gebildet.

Da Replikationsmaschinen nicht relativ zu Vorlagen -DNAs wie Fabriken bewegt werden, werden sie als a genannt Replikationsfabrik.[39] In einer alternativen Figur ähneln DNA -Fabriken den Projektoren und DNAs sind wie filmische Filme, die ständig in die Projektoren übergehen. Im Replikationsfabrikmodell laufen die Helikasen entlang der DNAs ineinander ineinander. Die Helikasen bleiben für den Rest des Replikationsprozesses verbunden. Peter Meister et al. beobachtet direkt Replikationsstellen in angehende Hefe durch Überwachung grünes fluoreszierendes Protein (GFP) -Tagged DNA-Polymerasen α. Sie erkannten die DNA -Replikation von Paaren der markierten Loci, die symmetrisch von einem Replikationsursprung getrennt sind, und stellten fest, dass der Abstand zwischen den Paaren nach der Zeit deutlich abnahm.[40] Dieser Befund legt nahe, dass der Mechanismus der DNA -Replikation mit DNA -Fabriken passt. Das heißt, Paare von Replikationsfabriken werden auf Replikationsursprünge und die miteinander verbundenen Fabriken geladen. Auch Template DNAs bewegen sich in die Fabriken, die die Extrusion der Vorlage SSDNAs und neuen DNAs bringen. Meisters Befund ist der erste direkte Beweis für das Replikationsfabrikmodell. Nachfolgende Untersuchungen haben gezeigt, dass DNA -Helikasen in vielen eukaryotischen Zellen Dimere bilden und während der DNA -Synthese an einer intranuklearen Lage an einer intranukleären Lage bleiben.[39]

Die Replikationsfabriken führen eine Entwirrung von Schwesterchromatiden durch. Die Entwirrung ist für die Verteilung der Chromatiden nach DNA -Replikation wesentlich für die Verteilung der Chromatiden. Weil Schwester Chromatiden nach der DNA -Replikation gegenseitig durchhalten Kohäsin Ringe, es besteht die einzige Chance für die Entwirrung der DNA -Replikation. Die Reparatur von Replikationsmaschinen als Replikationsfabriken kann die Erfolgsrate der DNA -Replikation verbessern. Wenn sich Replikationsgabeln in Chromosomen frei bewegen, wird die Katenation von Kernen verschlimmert und behindert die mitotische Segregation.[40]

Beendigung

Eukaryoten leiten die DNA -Replikation an mehreren Stellen im Chromosom ein, sodass die Replikationsgabeln an vielen Stellen im Chromosom erfüllen und enden. Da Eukaryoten lineare Chromosomen haben, kann die DNA -Replikation nicht das Ende der Chromosomen erreichen. Aufgrund dieses Problems geht die DNA in jedem Replikationszyklus vom Ende des Chromosoms verloren. Telomere sind Regionen der sich wiederholenden DNA in der Nähe der Enden und helfen, aufgrund dieser Verkürzung den Verlust von Genen zu verhindern. Die Verkürzung der Telomere ist ein normaler Prozess in somatische Zellen. Dies verkürzt die Telomere des Tochter -DNA -Chromosoms. Infolgedessen können Zellen nur eine bestimmte Anzahl von Malen dividieren, bevor der DNA -Verlust eine weitere Teilung verhindert. (Dies ist als die bekannt Hayflick -Grenze.) Innerhalb der Keimzelle Linie, die DNA an die nächste Generation übergeht, Telomerase erweitert die sich wiederholenden Sequenzen der Telomerregion, um eine Verschlechterung zu verhindern. Telomerase kann in somatischen Zellen fälschlicherweise aktiv werden und manchmal dazu führen Krebs Formation. Eine erhöhte Telomeraseaktivität ist eines der Kennzeichen von Krebs.

Die Beendigung erfordert, dass der Fortschritt der DNA -Replikationsgabel stoppen oder blockiert werden muss. Die Beendigung an einem bestimmten Ort beinhaltet, wenn es auftritt, die Wechselwirkung zwischen zwei Komponenten: (1) eine Terminierungsstellensequenz in der DNA und (2) ein Protein, das an diese Sequenz bindet, um die DNA -Replikation physisch zu stoppen. Bei verschiedenen Bakterienarten wird dies als DNA-Replikations-Terminus-Standort-Bindungsprotein bezeichnet, oder Ter Protein.

Da Bakterien kreisförmige Chromosomen aufweisen, tritt die Beendigung der Replikation auf, wenn sich die beiden Replikationsgabeln am gegenüberliegenden Ende des Elternchromosoms treffen. E coli reguliert diesen Prozess durch die Verwendung von Terminationssequenzen, die, wenn sie an die gebunden sind TUS ProteinAktivieren Sie nur eine Replikationsgabelung, um durchzugehen. Infolgedessen werden die Replikationsgabeln darauf gezwungen, sich immer innerhalb des Kündigungsbereichs des Chromosoms zu treffen.[41]

Verordnung

Hauptartikel: Zellteilung und Zellzyklus
Der Zellzyklus von eukaryotischen Zellen.

Eukaryoten

Innerhalb von Eukaryoten wird die DNA -Replikation im Kontext der kontrolliert Zellzyklus. Wenn die Zelle wächst und sich teilt, führt sie durch Stadien im Zellzyklus; Die DNA -Replikation erfolgt während der S -Phase (Synthesephase). Der Fortschritt der eukaryotischen Zelle durch den Zyklus wird durch kontrolliert Zellzyklus -Kontrollpunkte. Das Fortschreiten durch Checkpoints wird durch komplexe Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Proteinen kontrolliert, einschließlich Cyclin und Cyclin-abhängige Kinasen.[42] Im Gegensatz zu Bakterien repliziert die eukaryotische DNA in den Grenzen des Kerns.[43]

Der G1/S -Checkpoint (oder Restriction Checkpoint) reguliert, ob eukaryotische Zellen in den Prozess der DNA -Replikation und der anschließenden Teilung eintreten. Zellen, die diesen Kontrollpunkt nicht durchlaufen, bleiben im G0 -Stadium und replizieren ihre DNA nicht.

Nach dem Durchgang des G1/S -Kontrollpunkts muss die DNA in jedem Zellzyklus nur einmal repliziert werden. Wenn sich der MCM-Komplex vom Ursprung entzieht, wird der Vorreplizierungskomplex abgebaut. Da ein neuer MCM-Komplex nicht an einem Ursprung geladen werden kann, wenn die Vor-Replikations-Untereinheiten reaktiviert sind, kann ein Ursprung der Replikation im selben Zellzyklus nicht zweimal verwendet werden.[24]

Die Aktivierung von S-CDKs in der frühen S-Phase fördert die Zerstörung oder Hemmung individueller Komponenten des Vorreplikationskomplexes und verhindert eine sofortige Wiederaufnahme. S und M-CDKs blockieren weiterhin die Montage des Vorreplikationskomplexes auch nach Abschluss der S-Phase, um sicherzustellen, dass die Montage nicht erneut auftreten kann, wenn die gesamte CDK-Aktivität bei der späten Mitose verringert wird.[24]

Bei der Knospenhefe wird die Hemmung der Assemblierung durch CDK-abhängige Phosphorylierung von Komponenten vor der Replikationskomplex verursacht. Zu Beginn der S -Phase die Phosphorylierung von Cdc6 durch CDK1 verursacht die Bindung von Cdc6 an die Scf Ubiquitin -Proteinligase, was proteolytische Zerstörung von Cdc6 verursacht. Die CDK-abhängige Phosphorylierung von MCM-Proteinen fördert ihren Export aus dem Kern zusammen mit Cdt1 während der S-Phase und verhindert die Belastung neuer MCM-Komplexe an den Ursprüngen während eines Einzelzellzyklus. Die CDK-Phosphorylierung des Ursprungsreplikationskomplexes hemmt auch den Ansammlung des Vorreplikationskomplexes. Das individuelle Vorhandensein dieser drei Mechanismen reicht aus, um den Ansammlung des Vorreplikationskomplexes zu hemmen. Mutationen aller drei Proteine ​​in derselben Zelle auslösen jedoch die Reinitiation bei vielen Ursprüngen der Replikation innerhalb eines Zellzyklus.[24][44]

In tierischen Zellen das Protein Geminin ist ein wichtiger Inhibitor der Vorbereitungskomplex-Montage. Geminin bindet Cdt1 und verhindert seine Bindung an den Ursprungserkennungskomplex. In G1 werden die Geminin -Spiegel durch die APC niedrig gehalten, was Ubiquitination Geminin für den Abbau auf sie abzielt. Wenn Geminin zerstört wird, wird CDT1 freigegeben, sodass es in der Montage des Vorbereitungskomplexes funktionieren kann. Am Ende von G1 wird die APC inaktiviert, sodass Geminin Cdt1 ansammeln und binden.[24]

Die Replikation von Chloroplasten und mitochondrialen Genomen tritt unabhängig vom Zellzyklus durch den Prozess von auf D-Loop-Replikation.

Replikationsfokus

In Wirbeltierzellen konzentrieren sich Replikationsstellen in Positionen, die genannt werden Replikationsfoki.[40] Replikationsstellen können durch Immunfärbung von Tochtersträngen und Replikationsenzymen und Überwachung von GFP-markierten Replikationsfaktoren nachgewiesen werden. Nach diesen Methoden wurde festgestellt, dass Replikationsorte unterschiedlicher Größe und Positionen in der S -Zellteilung auftreten und ihre Anzahl pro Kern weit kleiner ist als die Anzahl der genomischen Replikationsgabeln.

P. Heun et al.,[40](2001) verfolgten GFP-markierte Replikationsorte in angehenden Hefezellen und zeigten, dass sich die Replikationsursprünge in der G1- und S-Phase ständig bewegen und die Dynamik in S -Phase signifikant abgenommen.[40] Traditionell wurden Replikationsstellen auf die räumliche Struktur von Chromosomen durch festgelegt Nuklearmatrix oder Lamine. Die Ergebnisse des HEun verweigerten die traditionellen Konzepte, angehende Hefen haben keine Lamine und stützen die Replikationsursprünge Selbstorganisation und Replikationsfoki.

Durch das Entlassen von Replikationsursprüngen, die räumlich und zeitlich kontrolliert werden, wird die Bildung von Replikationsorten reguliert. D. A. Jackson et al. (1998) zeigten, dass die benachbarten Ursprünge gleichzeitig in Säugetierzellen feuern.[40] Die räumliche Gegenüberstellung von Replikationsstellen bringt Clustering von Replikationsgabeln. Das Clustering tun Rettung von blockierten Replikationsgabeln und bevorzugt den normalen Fortschritt der Replikationsgabeln. Der Fortschritt der Replikationsgabeln wird durch viele Faktoren gehemmt. Kollision mit Proteinen oder Komplexen, die stark an DNA binden, Mangel an DNTPs, Nicks auf Template -DNAs usw. Wenn die Replikationsgabeln Stall und die verbleibenden Sequenzen aus den bestandenen Gabeln nicht repliziert werden, haben die Tochter-Stränge Nick-erhalten nicht replikierte Stellen. Die nicht replikierten Standorte auf dem Strang eines Elternteils halten den anderen Strang zusammen, aber keine Tochterstränge. Daher können sich die resultierenden Schwesterchromatiden nicht voneinander trennen und können sich nicht in 2 Tochterzellen unterteilen. Wenn benachbarte Herkunftsfeuer und eine Gabel von einem Ursprung ins Stocken geraten, Gabel von einem anderen Ursprung auf eine entgegengesetzte Richtung der bestandenen Gabel und duplizieren die nicht replikierten Stellen. Als anderer Mechanismus der Rettung gibt es die Anwendung von ruhende Replikationsursprünge Diese überschüssigen Ursprünge feuern nicht in der normalen DNA -Replikation ab.

Bakterien

Damm methyliert Adenin der GATC -Stellen nach der Replikation.

Die meisten Bakterien durchlaufen keinen gut definierten Zellzyklus, sondern kopieren ihre DNA kontinuierlich. Während des schnellen Wachstums kann dies zum gleichzeitigen Auftreten mehrerer Replikationsrunden führen.[45] Im E coli, Die am besten charakterisierten Bakterien, DNA-Replikation, wird durch mehrere Mechanismen reguliert, darunter: Hämethylierung und Sequestrate der Ursprungssequenz, das Verhältnis von Adenosintriphosphat (ATP) zu Adenosin -Diphosphat (ADP)und die Spiegel der Protein -DNAA. All diese steuern die Bindung von Initiatorproteinen an die Ursprungssequenzen.

Da E coli Methylate GATC -DNA -Sequenzen, DNA -Synthese führt zu hämethylierten Sequenzen. Diese hämethylierte DNA wird vom Protein erkannt SEQA, was die Ursprungssequenz bindet und sequestriert; Zusätzlich bindet DNAA (für die Initiierung der Replikation erforderlich) weniger gut an die hämethylierte DNA. Infolgedessen werden neu replizierte Ursprünge daran gehindert, eine weitere Runde der DNA -Replikation sofort zu initiieren.[46]

ATP baut sich auf, wenn sich die Zelle in einem reichhaltigen Medium befindet, und löst die DNA -Replikation aus, sobald die Zelle eine spezifische Größe erreicht hat. ATP konkurriert mit ADP, um an DNAA zu binden, und der DNAA-ATP-Komplex kann die Replikation initiieren. Für die DNA -Replikation ist auch eine bestimmte Anzahl von DNAA -Proteinen erforderlich - jedes Mal, wenn der Ursprung kopiert wird, verdoppelt sich die Anzahl der Bindungsstellen für DNAA, wobei die Synthese von mehr DNAA erforderlich ist, um eine weitere Initiierung der Replikation zu ermöglichen.

In schnell wachsenden Bakterien wie z. E coliDie Chromosomenreplikation braucht mehr Zeit, als die Zelle zu teilen. Die Bakterien lösen dies durch die Einleitung einer neuen Replikationsrunde, bevor der vorherige beendet wurde.[47] Die neue Replikationsrunde wird das Chromosom der Zelle bilden, das zwei Generationen nach der sich teilenden Zelle geboren wird. Dieser Mechanismus erzeugt überlappende Replikationszyklen.

Siehe auch: Ftsz, Min System, Plasmid, Plasmid -Kopiennummer, und Plasmid -Partitionssystem

Probleme mit der DNA -Replikation

Hauptartikel: DNA -Replikationsstress
Replikationsgabel Neustart durch homologe Rekombination nach Replikationsstress
Epigenetische Folgen von Nucleosomen -Zusammenbaustörungen bei blockierten Replikationsgabeln

Es gibt viele Ereignisse, die zu Replikationsstress beitragen, darunter:[48]

Polymerase Kettenreaktion

Hauptartikel: Polymerase Kettenreaktion

Forscher replizieren üblicherweise DNA in vitro Verwendung der Polymerase Kettenreaktion (PCR). PCR verwendet ein Paar von Primer Um eine Zielregion in der Template -DNA zu überspannen, und dann die Partnerstränge in jeder Richtung von diesen Primern unter Verwendung eines thermostbaren DNA -Polymerase. Das Wiederholen dieses Vorgangs durch mehrere Zyklen verstärkt die gezielte DNA -Region. Zu Beginn jedes Zyklus wird die Mischung aus Vorlage und Primern erhitzt und trennt das neu synthetisierte Molekül und die Vorlage. Wenn sich die Mischung abkühlt, werden beide Vorlagen zum Glühen neuer Primer, und die Polymerase erstreckt sich von diesen. Infolgedessen verdoppelt die Anzahl der Kopien der Zielregion jeweils Runde, exponentiell zunehmen.[49]

Siehe auch

Anmerkungen

  1. ^ Das Energetik Von diesem Prozess kann auch dazu beitragen, die Richtung der Synthese zu erklären - wenn die DNA in der 3'- bis 5' -Richtung synthetisiert wurde, würde die Energie für den Prozess eher vom 5' -Ende des wachsenden Strangs als aus freien Nukleotiden stammen. Das Problem ist, dass, wenn sich die Hochenergietriphosphate am wachsenden Strang und nicht auf den freien Nukleotiden befanden Das Rückgrat zwischen dem neuen Nukleotid und dem Rest des Strangs. Wenn das zugesetzte Nukleotid nicht übereinstimmt, würde die Entfernung zu einem DNA -Strang führen, der von einem Monophosphat am Ende des "wachsenden Strangs" und nicht mit einem hohen Energietriphosphat beendet wäre. Also würde Strand stecken bleiben und nicht mehr wachsen können. Tatsächlich stammen die bei jedem Schritt hydrolysierten Hochenergietriphosphat aus den freien Nukleotiden, nicht aus dem polymerisierten Strang, sodass dieses Problem nicht vorhanden ist.

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